형광 이미지 분석–스페로이드 내 세포 분열

세포핵과 미소관을 착색하여 스페로이드 내의 세포 분열을 시각화할 수 있습니다. 레이저 컨포칼 현미경 및 NoviSight™ 소프트웨어의 계수 모듈로 캡처된 이미지를 사용하여 스페로이드 내 유사분열 세포 수를 정량적으로 평가할 수 있습니다.

목적

유사분열 세포 또는 비정형 유사분열 세포의 수를 측정하여 암 조직의 악성 정도를 평가합니다. 유사분열 암세포 수는 일반적으로 유동 세포 분석법으로 결정됩니다. 이 기법에서 암 조직이 분리되어 있으며 2D 또는 3D 세포 배양 여부와 상관없이 핵은 유사분열 세포 수를 계산하기 위해 착색되어 있습니다. 하지만 유동 세포 분석법으로는 조직의 원래 3D 구조를 시각화할 수 없기 때문에 암 조직 내 유사분열 세포의 편재화를 식별하는 것이 불가능합니다. 종양 크기 같은 형태적 정보와 및 세포 분열 간 관계를 분석하는 것도 어렵습니다. 본 연구에서는 핵과 미소관을 착색하고 뒤이어 조직을 투명화하여 온전한 종양 스페로이드 내 유사분열 세포를 성공적으로 시각화하였습니다. NoviSight™ 소프트웨어와 결합된 이 기법을 통해 유사분열 세포의 수를 계산할 수 있었습니다. 이미지의 정량적 분석을 통해 유사분열 세포 및 비정형 유사분열 세포의 위치 식별이 가능하였습니다.

샘플 제공

HT-29의 세포 현탁액을 500개 세포/웰로 PrimeSurface® 96U plate(SUMITOMO BAKELITE CO., LTD)에 파종하였습니다. 5일 배양 후 세포는 스페로이드 구조를 형성하였고 스페로이드는 다양한 농도의 Paclitaxel로 처리되었습니다. Paclitaxel의 추가 후 스페로이드를 48시간 동안 배양한 후 4% 파라포름알데히드로 고정시켰습니다. 세포 핵과 미소관을 Hoechst33342(DOJINDO) 및 Alexa Fluor 488-복합 항 Tubulin 항체(eBioscience)로 각기 착색하였습니다. 착색된 스페로이드를 37°C로 하룻밤 동안 조직 투명화 시약인 ScaleS로 처리하였습니다.

결론
형광 이미지의 획득 및 분석

FV3000 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 스페로이드의 형광 이미지를 획득하였습니다. 미처리 대조군에서 유사분열 세포의 특징인 미소관에 의한 방추체 형성이 스페로이드 표면에서 3개의 세포 레이어에 관찰되었습니다(A). 대조군 및 Paclitaxel 처리 그룹 내 유사분열 세포 수를 계산하는 데 NoviSight™ 소프트웨어가 사용되었습니다(B,C). 그 결과, 농도 의존적 방식으로 유사분열 세포 수를 증가하였습니다(D). 결과는 미소관 해중합 억제제로서 Paclitaxel의 효과를 분명히 보여줍니다.

PrimeSurface는 Sumitomo Bakelite Co., Ltd의 등록 상표입니다.
Olympus는 등록 상표이며 NoviSight 및 Insightful Analysis, Intelligent Answers는 Olympus Corporation의 상표입니다.