FLUOVIEW FV3000을 사용한 마모셋 뇌의 피질과 시상 사이의 신경구조 관찰

전전두엽 피질(PFC)은 인간에서 불균형적으로 확대되며 고급 인지 및 실행 기능을 담당합니다.PFC가 오작동하면 정신 분열증과 알츠하이머병 같은 정신 장애를 일으킬 수 있습니다.마우스의 PFC에 대해서는 연구가 활발하게 이루어졌지만, 마우스는 전두무과립피질에 해당하는 영역이 부족하여 영장류와 구조적 차이가 큽니다.따라서 영장류 모델에 대한 연구는 마우스와 인간 연구를 연결하는 데 중요합니다.우리 연구 그룹은 남미에 서식하는 작은 원숭이인 마모셋을 영장류 모델로 삼고 있습니다.

이 실험에서 우리는 PFC와 시상을 둘러싸고 있는 억제성 뉴런 그룹인 시상망상핵(TRN) 사이의 상호작용을 조사했습니다.TRN은 대뇌피질에서 시상으로 정보 전달을 제어하는 ​​관문 역할을 합니다.우리는 PFC에서 시상으로 가는 TRN에서 축삭섬유의 세밀한 형태를 조사했습니다.

그림 1.신경 축삭이 시상망상핵을 통해 전전두엽 피질에서 시상으로 들어가는 방법을 보여주는 다이어그램.시상망상핵은 시상으로 가는 관문 역할을 합니다.

간단한 워크플로를 사용한 매크로-마이크로 이미징

PFC에서 비롯된 축삭섬유는 두꺼운 다발인 속섬유막(내포)이라는 통로를 통과합니다.이 축삭 다발은 TRN의 앞쪽 부분을 통해 시상으로 들어가며, 여기서 분할과 재배열을 통해 복잡한 형태를 보여줍니다.TRN을 정확하게 식별하기 위해 우리는 PV(파브알부민)를 표지자로 사용했습니다(그림1).

FLUOVIEW FV3000 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경의 매크로-마이크로 기능은 공초점 이미징을 위해 매크로 보기와 마이크로 보기를 원활하게 연결합니다.우리는 이 기능을 사용하여 PV 양성 세포를 통과하는 PFC 축삭섬유의 저배율 개요 이미지를 얻은 다음 고배율로 전환하여 미세축삭섬유와 단추 모양 신경종말의 분지를 관찰했습니다.

고배율 관찰을 위해 실리콘 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 샘플의 더 깊숙한 부분을 고분해능으로 자세히 관찰했습니다.저배율에서는 TRN을 통과하는 두꺼운 축삭섬유를 관찰할 수 있었습니다.40배율 실리콘 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여, 통과하는 섬유가 미세하게 분지되고 단추 모양의 수많은 과립 구조로 장식되어 있는 것을 관찰할 수 있었습니다(그림2).

그림 2.매크로-마이크로 기능을 사용하여 축삭섬유가 마모셋 뇌의 PFC에서 시상으로 가는 도중에 TRN과 만나는 위치를 매핑합니다. TRN 뉴런은 PV 양성 억제 뉴런으로 구성되어 있으므로 PV 항체(적색)로 식별할 수 있습니다.녹색은 대뇌피질의 축삭 종말을 나타내고 청록색은 핵을 나타냅니다.

이미징 조건
현미경: FLUOVIEW™ FV3000 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경
레이저: 405nm(DAPI, 청록색), 488nm(GFP, 녹색), 561nm(파브알부민, 적색)

a.대물렌즈: PLAPON1.25X, 스티칭: 3 × 3, 스케일 바: 3,000μm
b.대물렌즈: UPLXAPO10X, 스티칭: 2 × 2, 스케일 바: 300μm
c.대물렌즈: UPLSAPO40XS, 스티칭: 2 × 2, 73개 슬라이스 스케일 바: 30μm(녹색 및 적색만 표시됨)

축삭섬유 미세구조를 고분해능 3차원으로 관찰

그런 다음 3차원 재구성을 위해 100배 실리콘 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 Z 스택 이미지를 촬영했습니다(그림3).우리는 TRN 뉴런을 둘러싸고 있는 단추처럼 보이는 과립의 상세한 3차원 구조를 관찰할 수 있었습니다.

Watakabe 박사의의견

이 실험에서는 저배율 대물렌즈와 고배율 대물렌즈 사이를 전환해야 했습니다.FV3000 현미경의 매크로-마이크로 매핑 기능은 이러한 전환을 원활하게 구현했으며, 우리는 뇌의 전체 이미지를 탐색하면서 미세구조를 고배율로 포착할 수 있었습니다.실리콘 오일 이멀젼 대물렌즈의 사용은 단추처럼 보이는 신경종말의 미세한 형태를 관찰하는 데 도움이 되었습니다.

연구 배경

이 연구는 “질병 연구를 위한 통합 신경 기술에 의한 뇌 매핑”(Brain/MINDS) 프로젝트의 일환으로 수행되었습니다.이 프로젝트는 인간의 신경정신계 장애에 대한 이해를 심화하고 영장류 모델의 신경 회로를 조사하여 궁극적으로 이 장애를 극복하는 것을 목표로 합니다.Akiya Watakabe박사는 특히 전전두엽 피질(PFC)의 연결에 중점을 둔 마모셋 뇌 구조 지도 작성을 담당하는 연구 그룹에 속해 있습니다.

관련 논문:
Okano, H.,Sasaki, E.,Yamamori, T.,Iriki, A.,Shimogori, T.,Yamaguchi, Y.,Kasai, K.,Miyawaki, A.“Brain/MINDS:.”Neuron.,2016년 11월2;92(3):582~590. doi:10.1016/j.neuron.2016.10.018.

FV3000 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 실험을 지원한 방식

실리콘 오일 이멀젼 대물렌즈: 두꺼운 조직 샘플에서 밝은 이미지 구현

Olympus의 다양한 고성능 실리콘 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하면 투명 표본의 심조직을 고분해능으로 관찰할 수 있습니다.실리콘 오일의 굴절률(약 ne 1.40)은 생체조직의 굴절률(약 ne 1.38)에 가깝기 때문에 굴절률 변화로 인한 구면수차를 방지하여 조직 구조를 3D 분해능으로 획득할 수 있습니다.