세정된 표본에서 심부 조직 관찰을 위한 공초점 레이저 스캐닝 현미경에 실리콘 침지 대물렌즈 사용

표본을 투명하게 만드는 투명화 기법을 사용한 심도 있는 조직 관찰

생물표본을 투명하게 만드는 투명화 기법인 “Scale”의 사용과 관련된 최초 연구 중 하나가 Nature Neuroscience*의 2011년 8월호에 발표되었습니다. 그 이후 SeeDB, Clarity, ScaleS, Clear See 같이 샘플을 투명하게 만드는 다양한 기법이 개발되었습니다. 이러한 기법은 8mm 깊이로 조직 내부를 관찰하기 위한 2-광자 현미경과 함께 사용됩니다. 현재 2-광자 현미경은 제한된 수의 연구소에만 사용할 수 있으므로 널리 사용 가능한 레이저 컨포칼 현미경을 사용하여 투명화된 표본을 관찰하는 새로운 방법들이 개발되었습니다.

투명화된 표본의 심도 있는 조직 관찰을 위한 레이저 컨포칼 현미경 사용 시 대물렌즈의 선택이 중요합니다. 이러한 표본 관찰 시 Olympus의 실리콘 이멀젼 대물렌즈 라인업이 뛰어난 성능을 제공합니다. 이 애플리케이션 노트에서는 FLUOVIEW^® 시리즈 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 및 실리콘 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 세정된 표본 내에서 심도 있는 조직의 고해상도 관찰의 두 가지 예를 살펴봅니다.

*Hama, Hiroshi, Hiroshi Kurokawa, Hiroyuki Kawano, Ryoko Ando, Tomomi Shimogori, Hisayori Noda, Kiyoko Fukami, Asako Sakaue-Sawano 및 Atsushi Miyawaki. “Scale: 투명한 쥐 뇌의 형광 이미징 및 재현을 위한 화학적 방법.” Nature neuroscience 14, no. 11 (2011): 1481–1488.

SCALEVIEW-A2를 사용하여 투명화된 쥐 뇌 부분의 심도 있는 조직 관찰

SCALEVIEW^®-A2는 생물표본을 투명하게 만드는 데 사용되는 Olympus의 제품입니다. SCALEVIEW-A2는 포르말린으로 고정된 생물표본의 빛 흡수 또는 형광을 줄이지 않고 빛 산란을 제거합니다. SCALEVIEW-A2 용액에 포유류 뇌 표본을 침지하면 표본이 투명하게 됩니다. 뇌 표본을 자르지 않고 조직의 표면에서 심층부까지 형광 단백질로 표지된 구조를 상세히 관찰할 수 있습니다.

FLUOVIEW 시리즈 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 SCALEVIEW-A2로 투명화된 쥐 뇌 부분의 이미지를 획득하였습니다. 60X 오일 이멀젼 대물렌즈로 이미지를 촬영하였으며 60X 실리콘 이멀젼 대물렌즈 UPLSAPO60XS2로 촬영한 이미지와 비교하였습니다.

X-Z		X-Y
UPLASAPO60XO （NA: 1.35, W.D.: 0.15mm)
		Z=5μm	Z=35μm, 기준자: 5μm
UPLASAPO60XS2（NA: 1.30, W.D.: 0.30mm)
		Z=5μm	Z=35μm

투명화된 후 60X 오일 이멀젼 대물렌즈와 60X 실리콘 이멀젼 대물렌즈로 촬영된 쥐 대뇌 신피질 부분의 심도 있는 조직 이미지 간의 비교. (형광 항체 염색: VGluT1(녹색)/ VGluT2(빨간색)/ MAP2(파란색))

기존 오일 이멀젼 대물렌즈 및 실리콘 이멀젼 대물렌즈로 쥐 신피질의 XY 이미지를 촬영하였습니다. 대물렌즈를 사용한 두 경우 모두 밝은 형광 이미지가 획득되었지만 실리콘 이멀젼 대물렌즈 사용 시 획득된 35μm 깊이의 XY 이미지가 더 선명하게 밝았고 해상도가 더 높았습니다.
35μm에서 촬영된 이미지 간의 밝기 차이는 오일 이멀젼 렌즈의 구면 수차에 기인하며 이는 대물렌즈에 사용된 오일 유형의 굴절률(ne ≒1.52)과 투명화 용액 SCALEVIEW-A2의 굴절률(ne ≒1.38) 차이에 의한 것입니다.
실리콘 오일의 굴절률(ne ≒1.40)이 SCALEVIEW-A2의 굴절률에 가깝기 때문에 굴절률 불일치로 야기된 구면 수차가 줄어들어 실리콘 이멀젼 대물렌즈가 더 우수한 성능을 발휘합니다 따라서 사용자는 더 밝은 이미지를 캡처할 수 있습니다.
또한 실리콘 이멀젼 대물렌즈는 워터 이멀젼 대물렌즈보다 더 높은 개구수(NA)를 가지므로 연구원들은 워터 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 획득할 수 있는 것과 비교해 투명화된 조직 내 더 깊은 곳의 이미지를 더 높은 해상도로 획득할 수 있습니다.
더 높은 개구수 및 감소된 굴절률 불일치로 인해 실리콘 이멀젼 대물렌즈는 SCALEVIEW-A2로 투명화된 표본에 대한 심도 있는 조직 관찰 수행 시 우수한 성능을 발휘할 수 있습니다.
 

이미징 시스템
현미경: Olympus FV1200 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경
대물렌즈: UPLSAPO60XS2(60X, NA: 1.30, W.D.: 0.3mm)

이미지 데이터 제공:
Motokazu Uchigashima, M.D., Ph.D., Masahiko Watanabe, M.D., Ph.D.
홋카이도 대학 의과대학원 해부학과

ScaleU2 투명화 시약으로 투명화된 전체 태반의 심도 있는 조직 관찰을 위한 실리콘 이멀젼 대물렌즈 사용

저널 Development에 발표된 실험에서 연구원들은 40X 실리콘 이멀젼 대물렌즈 UPLSAPO40XS 및 FLUOVIEW 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 ScaleU2 시약으로 투명화된 표본에 대한 심도 있는 조직 관찰을 수행하였습니다.**

실험에서 형광 유비퀴틴화 기반 세포 주기 지표(Fucci) 발현 TG Mouse 태반(E10.5)을 ScaleU2로 세정하고 아가로스 겔로 고정시켰습니다. 40X 실리콘 이멀젼 대물렌즈 및 도립 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 태반 내 세포를 관찰하였습니다. ScaleU2 의 사용을 통해 연구원들은 조직 부분을 준비할 필요 없이 태반 내에 형태적으로 온전한 세포를 고해상도로 관찰할 수 있었습니다. 또한 실리콘 이멀젼 대물렌즈는 낮은 색수차를 가지도록 설계되어 있기 때문에 Fucci(S/G2/M-녹색, G1-빨간색)와 핵(DAPI-파란색)의 공동 국소화를 정밀하게 관찰할 수 있습니다.

그림 1: 전체 쥐 태반 내 세포의 관찰(E10.5)—개략도.

 그림 2: 전체 쥐 태반 내 세포의 관찰(E10.5)—순차 단층촬영.

그림 3: 태반 세포의 통합 이미지.
 

이미징 시스템
현미경: Olympus FV1000 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경
대물렌즈: UPLSAPO40XS(40X, NA: 1.25, W.D.: 0.3mm)
다이오드 레이저: 405nm, 473nm, 559nm
이미지 데이터 제공:
Asako Sakaue-Sawano Ph.D., Atsushi Miyawaki M.D., Ph.D.
RIKEN Brain Science Institute Laboratory for Cell Function Dynamics

참고문헌
**Sakaue-Sawano, Asako, Tetsushi Hoshida, Masahiro Yo, Reiko Takahashi, Kenji Ohtawa, Takashi Arai, Eiki Takahashi, Shinichi Noda, Hiroyuki Miyoshi 및 Atsushi Miyawaki. "Visualizing developmentally programmed endoreplication in mammals using ubiquitin oscillators." Development 140, no. 22 (2013): 4624–4632.

결론

Olympus의 실리콘 이멀젼 대물렌즈는 높은 개구수와 긴 작동 거리를 제공합니다. 실리콘 오일의 굴절률(ne ≒1.40)이 살아있는 조직의 굴절률ne ≒1.38)에 가깝기 때문에 굴절률 불일치로 야기된 구면 수차는 살아있는 두꺼운 조직의 고해상도 이미징에서 감소됩니다. 또한 실리콘 오일은 건조하게 되지 않기 때문에 사용자는 여러 날 동안 실험을 해도 오일을 추가할 필요가 없습니다. 실리콘 이멀젼 대물렌즈는 지속적으로 초점이 맞는 장기적인 안정적 고해상도 3D 이미징을 위한 IX-ZDC Z-드리프트 보상기와 호환됩니다.