오믹스 분석을 위한 살아있는 세포의 선택적 고립

Nils Körber^₁, Heide Marie Resch¹, Stefan Niehren^1
1독일 Eching, Molecular Machines & Industries GmbH
2019년 6월 28일

적요

단세포의 격리는 병리학, 종양학, 포렌식스에서 많은 연구 프로젝트의 필수 전제 조건입니다. 
MMI CellCut은 신선 냉동 또는 FFPE 재료 같은 조직 부분에서 레이저 현미해부를 촉진하도록 설계되어 있습니다. 
본 연구에서는 후속적 체학 분석을 위해 살아있는 세포를 MMI 격리 캡으로 바로 격리하기 위하여 특수 세포 배양 멤브레인 슬라이드와 함께 MMI CellCut 시스템을 쉽게 사용하는 방법을 보여줍니다. 

그림 1: Olympus IX83 도립현미경의 MMI CellCut 시스템. 이 시스템에는 현탁액에서 세포를 격리하기 위한 MMI CellEctor 미세모세관 시스템도 장착되어 있습니다.

서론

많은 다운스트림 방법들이 감도가 증가된 소량의 샘플에 대해 최적화되고 있음에 따라 단세포 체학 연구가 갈수록 인기를 얻고 있습니다. 따라서 미량의 샘플을 사용하는 RNA 추출 및 라이브러리 준비를 위한 여러 키트가 시판되고 있습니다¹.
최근 수년간 조직 부분 및 현탁 세포에 대해 단세포를 격리하기 위한 여러 방법들이 개발되었습니다. 하지만 이러한 방법들의 대부분은 개별 세포를 특정하게 선택하는 능력, 즉 예를 들어 형광 활성화 세포 선별(FACS)이 결여되어 있습니다. 또한 대부분의 기술이 죽은 세포나 고정된 세포로 제한되어 있는 반면, 일차 세포 배양으로부터 무균 상태에서 살아있는 세포를 부드럽게 격리하는 방법은 여전히 드뭅니다. 더욱이 살아있는 부착 세포의 가용화 중에 또는 세포 고정화 과정 중에 전사체학 또는 단백질체학 데이터가 크게 변경될 수 있습니다².
조직 부분에서 단세포 또는 세포 클러스터의 선택적 격리를 위해 레이저 현미해부를 사용하는 MMI CellCut이 처음 개발되었습니다(그림 1). 종양학, 병리학, 면역학, 포렌식스 및 작물학 같은 다양한 연구 분야에서 신선 냉동 또는 FFPE 재료를 사용하여 많은 발표를 통해 그 기능 및 능숙도가 입증되었습니다^3-7.
여기서는 생리학적 세포 배양 조건에서 살아있는 단세포를 격리한 후 다양한 체학 분석을 수행하기 위해 MMI 18웰 멤브레인 슬라이드와 함께 MMI CellCut을 효율적으로 사용할 수 있는 점을 보여줍니다. 본 연구에서는 무균 및 무오염 방식으로 MMI 18웰 멤브레인 슬라이드에서 MMI 격리 캡으로 단세포를 격리하는 반자동 워크플로를 설명합니다.

재료 및 방법

37°C(98.6°F) 및 10% CO₂에서 FBS, 비필수 아미노산, L-Glutamin 및 Penicillin-Streptomycin으로 보충된 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)에 HeLa 세포를 배양하였습니다. 20μl의 세포 현탁액(1 × 10⁴ 세포/ml)을 MMI 18웰 멤브레인 슬라이드(제품 번호 50304)의 각 웰로 이식하여 48시간 동안 배양하였습니다.
단세포 격리를 위해 층류 플로 후드 아래의 각 웰에서 10µl의 배지를 제거하였습니다. 교차 오염을 피하기 위해 MMI 18웰 멤브레인 슬라이드를 뒤집어 표준 유리 슬라이드에 놓았습니다(그림 2). 그런 다음 이 샌드위치를 후드에서 현미경 스테이지로 옮겼습니다.
Olympus IX83 도립 현미경에 장착된 MMI CellCut을 사용하여 단세포를 선택, 절단 및 격리하였습니다. MMI CellCut에는 정밀한 레이저 절단을 위한 MMI PicoCut 범용 레이저가 장착되었습니다. 세포를 0.5ml MMI 격리 캡(제품 번호 50204)에 바로 격리하였습니다.

그림 2: MMI 18웰 멤브레인 슬라이드 적용 방법의 도식 표현 A) MMI 18웰 멤브레인 슬라이드의 상면도. B) MMI 18웰 멤브레인 슬라이드를 뒤집어 표준 현미경 유리 슬라이드에 놓습니다. C) 샌드위치(유리 슬라이드, 세포, 멤브레인)가 형성되어 표적 세포를 온전한 상태로 유지하고 무오염 방식으로 격리시킬 수 있습니다. D) 이 샌드위치를 레이저 현미해부에 사용하기 위해 현미경에 놓습니다.

결과

MMI 18웰 슬라이드는 라이브 셀 레이저 현미해부용으로 특수 설계되어 있습니다. 이 슬라이드의 바닥은 표준 MMI 멤브레인 슬라이드에도 사용되는 PEN 멤브레인으로 구성되어 있습니다. 또한 MMI 18웰 멤브레인 슬라이드에는 최대 48시간 동안 세포가 배양되도록 약 20µl의 부피가 필요한 18웰로 구성된 플라스틱 프레임이 있습니다.
정밀하고 반복 가능한 절단 결과를 얻기 위해 MMI CellTools 소프트웨어 내에 레이저 초점 및 레이저 파워를 최적화하도록 빈 MMI 18웰 멤브레인 슬라이드가 사용되었습니다. 그런 다음 후속 실험에 동일한 설정이 사용되었습니다.
절단 전에 각기 다른 웰들 전체에 걸쳐 배지 누설로 인한 교차 오염을 방지하기 위해 각 웰에서 10µl의 배지를 제거합니다. MMI 18웰 멤브레인 슬라이드는 원래의 위치와 반대 방향으로 되어 있으며 표준 현미경 유리 슬라이드에 놓입니다(그림 3). 따라서 멤브레인이 맨 위에 위치하는 반면, 유리 슬라이드는 하단에 놓입니다.
이 작업은 샘플 무균 상태를 유지하기 위해 세포 배양 후드에서 수행됩니다. 그런 다음 유리 슬라이드가 현미경의 대물렌즈 쪽으로 향한 상태에서 무균 샌드위치는 MMI CellCut 시스템의 현미경 스테이지로 이동합니다.

그림 3: MMI CellCut의 인터랙티브 펜 스크린을 사용하여 선별되고 있는 HeLa 세포^*.

강력하고 사용하기 쉬운 MMI CellTools 소프트웨어를 사용하여 격리될 표적 세포용 샘플을 검사하고 찾을 수 있습니다(그림 3).
소프트웨어 내에 단세포를 표시할 수 있으며 PicoCut 레이저가 해당 세포 주위의 멤브레인을 정밀하게 절단합니다(그림 4). 그런 다음 자동 MMI CapLift 시스템이 멤브레인에서 원치 않는 세포들로부터 표적 세포를 바로 MMI 격리 캡으로 격리합니다. 격리 과정은 웰에 존재하는 액체에 의해 훼손되지 않으므로 세포 격리가 생리학적 조건에 부합합니다.
MMI CellCut 시스템 내에서 세포가 부드럽게 처리되며 격리 절차는 전사체학 데이터에 영향을 미치지 않습니다.

그림 4: 살아있는 단세포 격리 워크플로. A) 단세포를 표시합니다. B) 레이저가 이전에 표시된 선에 따라 세포 주위의 멤브레인을 정밀하게 절단합니다. C) MMI 격리 캡을 사용하여 세포를 들어올립니다. D) MMI 격리 캡의 표면에 초점을 맞춰 격리된 세포를 검사할 수 있습니다.

논의

본 연구에서는 MMI CellCut이 조직 부분을 절단할 수 있을 뿐 아니라 세포 배양 조건으로 유지되는 살아있는 세포를 격리할 수도 있는 것을 입증합니다. 부드러운 비침습성 기술을 통해 세포들이 생명을 유지할 수 있으며 세포의 체학 프로필은 영향을 받지 않습니다. 따라서 공정 부작용 없이 의미 있는 데이터를 확보할 수 있습니다.
이러한 새로운 세포 격리 절차를 이용하여 MMI CellCut은 공동 배양된 세포뿐 아니라 일차 세포 배양을 기반으로 연구 응용 범위를 확대합니다.  
애플리케이션 노트는 Molecular Machines and Industries의 허가를 얻어 게시하였습니다.

참고문헌

1. Yeri A, Courtright A, Danielson K, Hutchins E, Alsop E, Carlson E, et al. Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA. BMC Genomics [Internet]. 2018;19(1):331.
2. Huang, H.-L. et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17, 36 (2010).
3. AU - Baldacchino S, AU - Saliba C, AU - Scerri J, AU - Scerri C, AU - Grech G. Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material. JoVE [Internet]. 2018;(138):e57148.
4. Jonigk D, Rath B, Borchert P, Braubach P, Maegel L, Izykowski N, et al. Comparative analysis of morphological and molecular motifs in bronchiolitis obliterans and alveolar fibroelastosis after lung and stem cell transplantation. J Pathol Clin Res [Internet]. 2017 Jan 1;3(1):17–28.
5. Aas IB, Austbø L, Falk K, Hordvik I, Koppang EO. The interbranchial lymphoid tissue likely contributes to immune tolerance and defense in the gills of Atlantic salmon. Dev Comp Immunol [Internet]. 2017;76:247–54.
6. Costa S, Lima G, Correia D-S, Porto M, Caine L. Assessment of DNA and mtDNA Degradation in Sperm Cells Collected by Laser Micro-dissection [Internet]. Correia-de-Sa P, editor. Vol. 8, Journal of Forensic Research. OMICS International.,; 2017. p. 1–4.
7. Brandt R, Mascher M, Thiel J. Laser Capture Microdissection-Based RNA-Seq of Barley Grain Tissues. In: Murray GI, editor. Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols [Internet]. New York, NY: Springer New York; 2018. p. 397–409. 출처: https://doi.org/10.1007/978-1-4939-7558-7_23

* 비록 헬라 세포가 의료 연구에서 가장 중요한 세포주가 되었다고 해도, 과학에 대한 Henrietta Lacks의 공헌이 동의를 받지 않은 것이었다는 것을 인정해야만 합니다. 이로 인해 면역학, 전염병, 암에 대한 중요한 발견이 이루어졌지만 사생활, 윤리, 의학적 동의에 대한 중요한 논의도 촉발되었습니다.
Henrietta Lacks의 삶과 현대 의학에 대한 그녀의 공헌을 알아보려면 여기를 클릭하세요.
http://henriettalacksfoundation.org/