생명과학 솔루션
애플리케이션 노트

멤브레인 형태 및 분자 동역학 변경의 TIRF 이미징


Olympus의 Z-드리프트 보상 시스템을 사용한 세포막 아래의 멤브레인 형태 및 분자 동역학 변화의 전반사 형광(TIRF) 이미징

서론

현재 세포 생물학의 한 가지 중요한 이슈는 인접 세포 사이의 세포간 연락과 관련된 생리학적 현상의 메커니즘을 이해하는 것입니다. 이러한 목적을 달성하기 위한 유망한 조치는 세포간 부착 영역에서 편재화된 분자의 동역학 및 세포막 형태의 변화를 모니터링할 수 있게 해주는 라이브 셀 현미경의 사용입니다. 그림 1은 고정밀 TIRF 이미징이 어떻게 새로운 유형의 첨단 세포 연구를 가능하게 하는지를 보여줍니다. Olympus 전동 도립 현미경 IX 시리즈를 사용하여 캡처된 이미지는 세포막 아래의 멤브레인 형태 및 분자 동역학의 변화를 보여줍니다. Olympus Z-드리프트 보상기는 장시간 동안 세포에 대한 선명한 초점을 유지하며 이를 통해 연구원은 이러한 이미지를 고품질로 캡처할 수 있습니다. 이 과정에서는 고정밀 라이브 셀 이미징에 TIRF 및 Olympus Z-드리프트 보상기의 중요성을 보여줍니다.

Cos-1 세포의 타임 랩스 이미지
 그림 1. GFP-17 및 Lifeact-mCherry 공동 발현 Cos-1 세포의 타임 랩스 이미지.

원형질 막에서의 FBP17의 동원이 미오신 기반 수축력에 의해 야기된 막 인장의 일시적 감소에 좌우되는지 여부 조사. 미오신 억제제 블레비스타틴의 처리 후 FBP17이 세포 가장자리에서 갑자기 사라졌습니다(175초). 이러한 작용은 긴장과도의 완충(260초)으로 유발된 막 인장의 후속적 감소에 의해 해소될 수 있습니다. 이는 FBP17이 원형질 막에 막 인장이 모이는 것을 감지하는 것을 나타냅니다.

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the single molecule level under TIRF microscopy

 

GFP-17 및 Lifeact-mCherry 공동 발현 Cos-1 세포의 타임 랩스 동영상.

이미징 시스템
현미경: 연구용 도립현미경 IX81
대물렌즈: PlanApo 100XOTIRFM(100X, N.A.1.45)
CCD 카메라: Cascade II 냉각 CCD 카메라(Photometrics)
Z-드리프트 보상 시스템: IX-ZDC

이미지 데이터 제공:
Kazuya Tsujita, Ph.D., Toshiki Itoh, Ph.D.
고베 대학 첨단과학기술조직 생체신호연구센터

참고문헌:
Nat Cell Biol. 2015 Jun;17(6):749-58. doi: 10.1038/ncb3162.
J Cell Sci. 2013 May 15;126(Pt 10):2267-78. doi: 10.1242/jcs.12251

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Polarisation of FBP17 is induced by PM tension increase1

 

인장 증가로 FBP17의 편광이 유도됩니다.
긴장과소의 완충 시 GFP-FBP17 및 Lifeact-mCherry 공동 발현 COS-1 세포가 타임 랩스로 관찰되었습니다. 5초당 1프레임으로 동영상을 촬영하여 15fps로 재생하였습니다.

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Polarisation of FBP17 is induced by PM tension increase2

 

PM 인장 감소로 FBP17의 편광이 저해됩니다.
긴장과도의 완충 추가 시 GFP-FBP17 및 Lifeact-mCherry 공동 발현 COS-1 세포가 타임 랩스로 관찰되었습니다. 5초당 1프레임으로 동영상을 촬영하여 15fps로 재생하였습니다.

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Polarisation of FBP17 is induced by PtdIns(4,5)P2 liberation

 

PtdIns(4,5)P2 유리로 FBP17의 편광이 유도됩니다.
라파마이신의 추가 시 GFP-FBP17, CFP-FKBP-PLC δ1 PH 도메인 및 mRFP-FRB-MoA 공동 발현 COS-1 세포가 타임 랩스로 관찰되었습니다. 5초당 1프레임으로 동영상을 촬영하여 15fps로 재생하였습니다.

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Polarisation of FBP17 is disrupted by PtdIns(4,5)P2 depletion

 

PtdIns(4,5)P2 고갈로 FBP17의 편광이 저해됩니다.
라파마이신의 추가 시 GFP-FBP17, CFP-PM-앵커드 FRB 도메인 및 mRFP-FKBP-5-포스파타아제 도메인 공동 발현 COS-1 세포가 타임 랩스로 관찰되었습니다. 5초당 1프레임으로 동영상을 촬영하여 15fps로 재생하였습니다.

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Dynamics of FBP17 at the leading edge

 

앞 가장자리에서 FBP17의 동역학. GFP-FBP17 및 Lifeact-mCherry 공동 발현 COS-1 세포가 타임 랩스로 관찰되었습니다. 5초당 1프레임으로 동영상을 촬영하여 15fps로 재생하였습니다.

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Acute disruption of FBP17 polarity by N-WASP inhibition

 

N-WASP 억제에 의한 FBP17 극성의 급성 분열. 위스코스타틴의 추가 시 GFP-FBP17 및 Lifeact-mCherry 공동 발현 COS-1 세포가 타임 랩스로 관찰되었습니다. 10초당 1프레임으로 동영상을 촬영하여 15fps로 재생하였습니다.

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Acute disruption of FBP17 polarity by Arp2/3 complex inhibition

 

Arp2/3 복합 억제에 의한 FBP17 극성의 급성 파괴.
CK-666의 추가 시 GFP-FBP17 및 Lifeact-mCherry 공동 발현 COS-1 세포가 타임 랩스로 관찰되었습니다. 10초당 1프레임으로 동영상을 촬영하여 15fps로 재생하였습니다.

결론

Olympus의 라이브 셀 이미징 솔루션 및 Z-드리프트 보상기는 각종 세포 과정의 장기 이미징 연구를 촉진합니다. Z-드리프트 보상기는 낮은 광독성 적외선(IR)을 이용하여 올바른 초점 위치를 검출하고 자동 초점 조정을 수행하며 온도 변화 같은 인자로 인한 초점 편차를 방지하여 시간의 흐름에 따라 정밀한 초점 조정을 유지합니다. 상기 실험 유형은 시간의 흐름에 따라 캡처된 이미지가 초점 편차로 인해 초점이 맞지 않게 되기 때문에 기존 현미경 사용을 사용하여 달성될 수 없습니다. Z-드리프트 보상기를 통해 초점 손실 없이 이미지를 캡처할 수 있습니다. 모든 세포막 하에서 FBP17 및 Lifeact 액틴 표지의 동적 변화를 연대순으로 고정밀하게 추적할 수 있습니다.

이 애플리케이션에 사용되는 제품

TIRF 이미징 현미경 시스템

IXplore TIRF

  • 막 동역학 및 단일 분자 검출의 연구를 위한 우수한 동시 다색 TIRF 
  • 개별 투과 깊이 제어 덕분에 최대 4개 지표의 정확한 공존
  • 1.7*의 세계 최고 개구수를 자랑하는 Olympus의 주목할 만한 TIRF 대물 렌즈 이용(*2017년 7월25일 현재 기준. Olympus 연구에 따름)
  • GEM(Graphical Experiment Manager)으로 복잡한 실험을 사용하기 쉽게 설정
초고해상도/TIRF 이미징용 아포크로맷 대물 렌즈

APON-TIRF/UAPON-TIRF/UPLAPO-HR

  • 높은 개구수로 고대비 TIRF 이미지 또는 초고해상도를 위한 표면 파장 생성
  • HR 시리즈는 넓은 평탄도를 획득하는 NA1.5의 세계 최초* 플랜 아포크로맷 대물 렌즈입니다

* 2018년11월 기준. Olympus 연구에 따름.research.

Z 편차 보상기

TruFocus (IX3-ZDC2)

  • 항상 정초점
  • 사용 편의를 위한 설계
  • 라이브 셀 이미징 전용
  • cellSens 소프트웨어를 사용한 고정밀, 다중 영역 이미징

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