공초점 현미경을 사용하여 온칩 혈관 종양 스페로이드 관찰

연구에 따르면, 종양은 왕성한 활동을 하기 위해 혈관의 성장을 유도한다고 합니다. 이러한 혈관은 종양의 생명줄 역할을 하고 이러한 활동을 지지하도록 종양 미세환경(TME)에 중요한 역할을 합니다. 현재까지 정적 조건 하에서 생화학 및 생체역학적 자극에 대한 종양 반응이 평가되었으며 종양에 대한 혈류의 영향을 흡수하는 데 실패하였습니다. 본 연구에서는 관류형 혈관망을 통한 매질 흐름으로 종양 미세환경을 평가할 수 있고 혈류에 포함된 약물 투여의 효과를 측정하는 종양 칩(tumor-on-a-chip) 플랫폼을 제시합니다.

미세유체 소자 내 종양 스페로이드의 3D 관찰

그림 1. 미세유체 소자 및 종양 모델.
(좌측) 미세유체 소자의 이미지, (우측) 관류형 혈관망이 포함된 종양 모델.

본 연구에서는 미세유체 소자 내 인간 유방 선암 세포가 포함된 스페로이드(MCF-7)와 함께 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)를 공동 배양하여 혈관망을 포함한 종양 미세환경을 개괄하였습니다. 미세유체 소자 내 혈관망의 관류능을 확인하기 위해 FV3000RS 컨포칼 현미경을 사용하여 형광 비드(녹색)가 혈관망 및 스페로이드를 연속적으로 통과하였는지 여부를 관찰하였습니다. 3D 배양 샘플은 질량의 두께로 인해 이미지 획득이 어렵습니다. 검출될 만큼 강한 형광 신호를 생성하기 위해 더 높은 여기광 강도가 필요합니다. 하지만 여기광이 더 높을수록 광독성이 증가되어 세포가 손상됩니다. 이를 해결하기 위해 Olympus의 TruSpectral 검출 기술 및 고감도 GaAsP 검출기를 통합하는 FV3000 컨포칼 현미경을 사용하여 약한 형광 신호를 캡처하고 레이저 파워를 최소화하였습니다..

그림 2. 종양 스페로이드 및 혈관망.
핵： 청록색(405nm, Hoechst 33342）, RFP-HUVEC： 마젠타색(561nm, RFP）, E-cadherin： 노란색(640nm, Alexa Fluor 633）.
(a) 종양 스페로이드의 투사 이미지. 기준자: 200μm, 대물렌즈： UPLSAPO10X2.
(b) (a) 내 흰색 프레임의 3개 평면 이미지(x-y、x-z、y-z). 기준자: 20μm, 대물렌즈： UPLSAPO40X2.

공진 스캐너를 사용한 혈류의 고속 이미징

또한 형광 미세 비드를 사용하여 종양 스페로이드의 혈관망 내 흐름을 관찰하였습니다(녹색, 직경: 3.1μm). 빠른 혈류 관찰 시 보통 검류계 스캐너의 스캐닝 속도가 충분하지 않을 수 있습니다. 이 실험에서는 고속 공진 스캐너가 장착된 Olympus FV3000RS 컨포칼 현미경을 사용하여 이미지를 캡처하였습니다. 형광 미세 비드를 미세유체 소자의 채널 3으로 주입하였을 때 이 미세 비드가 스페로이드의 내강 구조를 통과하여 채널 1에 도달한 것이 확인되었습니다. 이는 조작된 혈관망의 관류능을 나타냅니다. TME에 미치는 혈류의 영향을 연구하기 위해 이 조작된 종양 스페로이드의 유효성을 확인 시에 혈관 내 흐름의 존재 또는 부재에 따라 혈관망을 포함한 TME 내의 약효가 다른 것이 후속적인 실험에서 밝혀졌습니다. 우리의 3D 모델이 향후 경혈관 약물 투여 모델로 신약 개발에 기여할 수 있을 것으로 기대합니다.

동영상: 미세유체 소자에 구축된 혈관 및 종양 스페로이드 내 형광 비드의 흐름.
이미징 조건: 65밀리초/프레임. 기준자: 100μm.

Dr. Yokokawa의 견해

본 연구의 참신성은 종양 스페로이드에 구축된 관류형 혈관망에 있습니다. 혈관망이 스페로이드와 미세유로 채널을 연결하는 방법을 시각화하는 것이 중요하였습니다. 더욱이 관류능을 입증하기 위해 혈관 내강과 맥관 구조의 관류를 동시에 관찰하는 것이 필수적이었습니다. FV3000 컨포칼 현미경에 설치된 고속 공진 스캐너를 통해 혈관망(RFP-표지됨)과 미세 비드(녹색)의 동적 흐름의 이미징이 가능하였습니다.

감사의 말
이 애플리케이션 노트는 다음 연구원들의 도움으로 작성되었습니다.
교토 대학 마이크로 공학과¹
도호쿠 대학 학제간과학 프런티어 연구소(FRIS)²

참고문헌
Nashimoto Y, Okada R, Hanada S, Arima Y, Nishiyama K, Miura T, Yokokawa R. Biomaterials. 2020, Jan;229:119547. "Vascularized cancer on a chip: The effect of perfusion on growth and drug delivery of tumor spheroid.” DOI: 10.1016/j.biomaterials.2019.119547

FV3000 컨포칼 현미경에 의한 실험 촉진 방법

고효율 GaAsP 검출기 기반의 완전 스펙트럼 시스템이 라이브 셀 이미징에 대한 고감도를 제공

FV3000 컨포칼 현미경 시리즈는 VPH(Volume-Phase Holograpic) 기술을 통해 투과된 빛을 회절시키는 Olympus의 TruSpectral 검출 기술이 특징입니다. 이 기술은 반사 유형 격자가 장착된 기존 스펙트럼 검출 장치보다 빛 처리량이 훨씬 더 높습니다. FV3000 현미경의 2채널 고감도 스펙트럼 검출기(HSD)는 신호 대 잡음비가 높은 45%의 양자 고효율을 위한 펠티어 냉각 GaAsP PMT로 TruSpectral 기술을 이용합니다. 이러한 검출 기술의 결합을 통해 강력한 고감도 검출을 제공하고 살아있는 조직 관찰에 필요한 레이저 파워를 최소화합니다.

두 가지 스캔 장치 옵션