컨포칼 레이저 스캐닝 현미경은 인기 있는 생물학적 연구 도구입니다. 이 현미경은 강화된 절편 기능으로 생물학적 표본 내의 심도 있는 이미지를 비롯하여 동시에 뛰어난 색 분리로 여러 형광단의 이미지를 획득하는 데 일반적으로 사용됩니다.
현재 최신 레이저 기술 혁신 덕분에 이러한 응용 도구의 사용 뿐 아니라 새로운 높은 단계의 실험이 가능해졌습니다. 이 블로그 게시물에서는 FV3000 컨포칼 현미경의 새 근적외선(NIR) 여기 레이저가 첨단 다중화 기법을 지원하는 방법을 살펴보겠습니다.*
컨포칼 현미경 관련 5+ 채널의 다중화 장애와 극복 방법
다중화 실험의 역사를 조명하면서 시작하겠습니다.
수년간 많은 연구원들이 DAPI 및 일반적으로 녹색 및 적색 스펙트럼의 두 가지 색으로 면역형광을 수행하였습니다.
항체와 이미징 시스템이 검출기 및 방사 파장 필터링 개선으로 발전됨에 따라 4색 면역형광이 인기를 얻게 되었습니다. DAPI, 녹색, 적색 및 원적색이 가장 일반적인 4색 조합이었습니다.
하지만 다중화의 5번째 채널의 도입을 향해 두 가지 중요 요소가 장애가 되었습니다.
1. 빔 품질이 우수한 NIR 레이저 다이오드의 부족.
첫째, 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경의 빔 품질이 우수한 NIR 레이저 다이오드가 널리 사용될 수 없었습니다. 적절한 출력(과도하지 않은 출력), 최소 출력 변동 및 호환 가능 빔 형상이 컨포칼 이미징에 사용되는 레이저 다이오드의 필요한 모든 특성입니다. 하지만 몇 년이 지날 때까지 이러한 파장 범위 내에서 소수의 NIR 레이저 다이오드 옵션만이 가능하였습니다.
그러나 최신 레이저 다이오드 기술 덕분에 이 모든 것이 바뀌었습니다. 이제 Olympus의 FV3000 컨포칼 현미경은 다음과 같은 2차 염료의 효율적 여기를 위해 730nm 및 785nm 레이저 다이오드를 제공합니다.
- 시아닌7 (Cy7)
- 알렉사 플루오르 750
- 알렉사 플루오르 790
- DyLight 800
- IRDye 800
- 인도시아닌 녹색(ICG)
새 형광단의 수가 증가함에 따라 이들 염료는 더욱 매력적인 다중화의 5번째 및 6번째 동시 채널을 추가하고 있습니다.
2. NIR 파장의 감도가 감소된 광전자 증배관
두 번째 장애는 많은 광전자 증배관(PMT)에서 730nm 및 785nm 여기에 전형적인 검출 파장의 감도가 감소된 것입니다.
근적외선 검출 범위에서 이러한 감도 감소는 가시 스펙트럼의 중간에서 더 높은 감도를 제공하는 인기 있는 GaAsP PMT에 특히 해당됩니다. 750+nm 범위에서 GaAsP 검출기의 감도는 거의 없습니다.
이러한 난점을 극복하기 위해 적색 이동 GaAs 검출기를 FV3000 컨포칼 레이저 현미경에 통합시켰습니다.
이제 FV3000 시스템은 다중알칼리(표준) PMT 및 GaAsP(고감도) PMT와 여러 가지 다양한 조합으로 GaAs 검출기를 제공합니다. 이러한 구성은 GaAs 검출기를 다중화 용도의 5번째 또는 6번째 채널*로 사용할 수 있습니다. (*일부 제한이 적용됨)
X 라인 고성능 대물렌즈와 결합된 FV3000 시스템은 400–1000nm의 광범위한 고품질 색수차 보정을 제공할 수 있습니다. 이에 따라 명시야 및 멀티 컬러 형광 이미징 중에 색 재현성이 크게 향상됩니다.
*이는 사용자 지정 솔루션이며 일부 지역에 제공되지 않을 수도 있습니다. 자세한 내용은 해당 지역 Olympus 판매대리인에게 문의하십시오.
