2014년에 노벨 화학상은 “초고해상도 형광 현미경의 개발”에 대해 세 명의 과학자에게 수여되었습니다. 그 결과, 지난 5년 동안 현미경 산업에서는 초고해상도 현미경 기술에 대한 관심이 폭증하였습니다.
이 용어가 낯선 사람들에게, 초고해상도 현미경은 기존 광학 현미경의 회절 한계보다 더 높은 해상도로 샘플을 보는 데 사용되는 광학 기술을 가리킵니다.
오늘의 블로그 게시물에서는 초고해상도 현미경을 심층적으로 살펴봅니다. 초고해상도 현미경의 한계를 알아보고 기존 현미경 시스템에 초고해상도를 적용할 수 있는 방법을 찾아봅니다.
초고해상도 현미경의 한계
오늘날 거의 모든 시판 현미경 제조업체들은 초고해상도 현미경을 제공합니다. 이들 현미경은 보통 컨포칼 현미경처럼 사용이 거의 간편하지만, 이것이 항상 그런 것만은 아니었습니다. 전문가가 작동시키고 조정할 필요가 없는 사용자 친화적 초고해상도 현미경을 만들어내는 데 수년이 걸렸습니다.
처음에 초고해상도 관심의 열풍이 연구계를 휩쓸었습니다. 하지만 이러한 실험을 수행하는 데 연구원들의 많은 노력이 필요하게 되면서 관심이 시들해졌습니다. 결과적으로 샘플 준비 수정, 이미징 매질 변경 또는 굴절률 일치 같은 지루한 작업을 수행하는 노력을 할 가치가 없었습니다.
컨포칼 현미경이 초고해상도 이미징을 수행할 수 있나요?
컨포칼 현미경에서 핀홀 크기를 1AU 아래로 줄이면 해상도 증가를 얻을 수 있다는 것이 정설이었습니다.
이론적으로는 그렇게 할 경우 흔히 고해상도로 정의되는 2x 해상도 증가를 얻을 수 있습니다. 하지만 풍부한 저주파 신호와 비교 시 고주파 신호가 약하기 때문에 실제로 해상도는 약 1.4x만 향상될 수 있다는 것이 밝혀졌습니다.
결과적으로 이러한 이미지 내에 이미 존재하는 기존 고주파 공간 정보를 이용하기 위해 컨포칼 현미경 같은 기존 기술을 향상시킬 수 있는 방법에 노력이 집중되었습니다. 자연스럽게 디콘볼루션이 떠올랐습니다.
디콘볼루션은 어떻게 작동하나요?
디콘볼루션 알고리즘은 획득된 이미지의 선명도 및 명료성을 증가시키기 위해 이론적 또는 획득된 정상 강도 분포 함수(PSF)에 기초하여 아웃포커스 광자를 원래 위치로 다시 재배치하여 작동합니다.
사실상 디콘볼루션 알고리즘만으로 하위 해상도 형광 비드의 크기를 반치전폭(FWHM)으로 줄여 광시야에 대해 측정된 2x 해상도 증가를 얻을 수 있습니다.
잠시 한 걸음 물러나서 현미경의 맥락에서 해상도를 정의하겠습니다. 전통적으로 해상도는 두 피사체를 별개의 피사체로 적절히 정의하기 위해 두 피사체 간에 26% 이상의 강도 감소가 있어야 하는 것으로 명시하는 레일리 기준을 사용하여 정의됩니다.
흔히 이를 2점(two-point) 해상도라고 합니다. 디콘볼루션을 통해 하위 해상도 피사체의 FWHM으로 축소하는 경우 이미지가 더 선명해지기는 하지만 초고해상도를 얻기에 충분하지 않을 수 있습니다.
이쯤이면 다음 질문을 하지 않을 수 없습니다. 실제 샘플에서 초고해상도 데이터를 얻는 데 디콘볼루션으로 충분한가요?
대답은 아니요입니다.
유명한 선형 디콘볼루션 방법 중 하나가 위너 필터입니다. 위너 필터는 동일한 방식으로 모든 고주파 데이터를 처리하며 아래 그림에 표시된 바와 같이 링잉 아티팩트의 형성을 초래합니다.
필터의 강도를 수정하거나 링잉 아티팩트에서 연구원들을 완전히 차단하면 이러한 아티팩트가 최소화된다고 주장하는 사람도 있습니다 하지만 사실상 해상도 한계 아래의 구조 관찰 시 큰 아티팩트는 허용되지 않습니다.
이러한 점을 염두에 두고 Olympus는 OSR(Olympus Super Resolution)을 개발하였습니다.
OSR(Olympus Super Resolution)로 선명한 (초고해상도) 이미지 획득
OSR(Olympus Super Resolution)이란 정확히 무엇인가요? OSR은 더 신뢰할 만한 결과를 제공하기 위해 특정 고주파 공간 정보를 증폭하거나 감쇠하는 여과 과정입니다.
이 과정은 디콘볼루션 알고리즘과 결합되어 초고해상도 이미지를 더 선명하고 더 명료하게 만들 수 있습니다.
OSR(Olympus Super Resolution)을 사용하여 현미경에서 선명한 이미지를 획득할 수 있는 방법을 알아보려면 오늘 당사에 문의하십시오.
