Introduction to Laser Scanning Microscopes

레이저 스캐닝 현미경은 레이저 조명을 사용해 샘플을 한 지점씩 스캔하여 샘플의 고해상도, 고대비 3D 이미지를 생성합니다.레이저 스캐닝 현미경의 두 가지 일반적인 유형은 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경과 다광자 레이저 스캐닝 현미경입니다.두 유형 모두 레이저를 사용하여 샘플을 여기시키지만, 두 유형 사이에는 몇 가지 중요한 차이점이 있습니다.여기에서는 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경과 다광자 레이저 스캐닝 현미경의 작동 방식, 용도, 생성 가능한 이미지 유형에 대해 설명합니다.

컨포칼 레이저 스캐닝 현미경의 원리

다광자 레이저 스캐닝 현미경의 원리

다광자 레이저 스캐닝 현미경은 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경과 매우 유사한 방식으로 작동합니다.단, 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경은 단파장 가시 레이저를 사용하여 샘플을 여기시키는 반면, 다광자 레이저 스캐닝 현미경은 단일 광자 여기에 필요한 것보다 2배 더 긴 파장에서 방출되는 펨토초 IR(적외선) 펄스 레이저를 사용합니다.샘플의 염료가 두 광자를 동시에 흡수하면 형광을 방출할 수 있습니다.이 2광자 흡수 현상은 광자 밀도가 매우 높은 초점 위치에서만 발생하며 초점의 염료만 여기되어 형광을 방출합니다.따라서 다광자 레이저 스캐닝 현미경 시스템은 NDD(비 디스캔 검출기, Non-Descanned Detector)에 대해 초점을 벗어난 형광을 차단하는 데 핀홀 조리개가 필요하지 않으며 초점에서 형광을 효율적으로 탐지할 수 있습니다.다른 여기 방법을 사용하는 이유는 더 긴 파장의 레이저가 조직 깊숙이 침투할 수 있어, 살아 있는 조직에서 수백 마이크로미터 깊이의 관찰과 이미징이 가능하다는 데 있습니다.또한, 단파장 가시 레이저에 비해 광독성이 적습니다.따라서 다광자 레이저 스캐닝 현미경은 살아 있는 동물 체내의 살아 있는 세포와 조직을 연구하는 데 더 적합합니다.

레이저 스캐닝 현미경 사용

컨포칼 레이저 스캐닝 현미경은 다양한 분야에서 매우 유용하고, 특히 생물학 연구에서 가장 흔히 사용됩니다.즉, 세포 생물학 연구, 암 연구, 줄기세포 연구에 많이 사용됩니다. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경은 세포의 매우 상세한 3D 이미지를 생성할 수 있어 관찰자가 스캔한 샘플 내부를 볼 수 있게 해주기 때문입니다.컨포칼 레이저 스캐닝 현미경이 광학적으로 빛을 절단하여 샘플을 물리적으로 절단할 필요 없이 두꺼운 조직 표본의 고해상도 이미지를 생성할 수 있어 가능한 일입니다.펨토초 IR 펄스 레이저가 깊이 침투하기 때문에 다광자 레이저 스캐닝 현미경은 살아 있는 동물 체내를 이미징하는 데 가장 적합합니다.따라서 이 현미경은 흔히 신경 과학 연구와 암 연구에 사용됩니다.

레이저 스캐닝 현미경의 장단점

레이저 스캐닝 현미경은 한 지점씩 표본을 스캔할 수 있는 기능 덕분에 세포와 생체 조직 연구에 꼭 필요한 현미경으로 사용되고 있습니다.컨포칼 레이저 스캐닝 현미경의 추가적인 장점은 샘플을 물리적으로 절단하지 않고도 세포와 조직의 고해상도, 고대비 3D 이미지를 생성할 수 있다는 것입니다.

레이저 스캐닝 현미경이 이러한 고품질 이미지를 생성할 수 있는 것은 공초점 핀홀을 통해 초점을 벗어난 형광광을 차단하는 데 매우 효율적이어서 한 번에 하나의 초점만 검출기에 의해 수집되기 때문입니다.

이런 이유로 표본의 완전한 3D 이미지를 컴파일하는 데 시간이 오래 걸릴 수 있습니다.그러나 프로세스 속도를 높이도록 장비가 개선되었습니다.기존 검류계 스캐닝과 비교하여 공진 스캐닝은 초당 최대 30프레임의 고속 이미징을 제공하여 세포 내 혈류 또는 이온 플럭스 등의 빠르고 역동적인 이벤트를 관찰할 수 있습니다.

레이저 스캐닝과스피닝 디스크 비교

레이저 스캐닝 현미경의 지점별 수집 기능의 속도를 높인 기술 발전의 한 예는 스피닝 디스크의 적용입니다.스피닝 디스크 컨포칼 현미경은 초점을 벗어난 형광광을 차단하는 데 사용되는 핀홀의 수와 관련이 있습니다.컨포칼 레이저 스캐닝 현미경은 단일 핀홀을 사용하지만, 스피닝 디스크 컨포칼 현미경은 고속으로 회전하는 수백 개의 핀홀이 있는 불투명 디스크를 사용합니다.그러면 샘플을 한 지점씩 이미징하는 것이 아니라 전체 표본을 한 번에 이미징할 수 있습니다.이렇게 되면 광손상과 광표백을 줄이는 데도 도움이 됩니다.

레이저 스캐닝 현미경 이미지

언급한 바와 같이 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경에서 고해상도 및 고대비 이미지가 가능한 것은 검출기에 도달하기 전에 핀홀을 통해 초점을 벗어난 형광광을 거부하기 때문입니다.3D 이미지가 만들어지면 관찰자는 특정한 경우에 이미지를 수정하고 내부를 탐색할 수도 있습니다.

레이저 스캐닝 현미경과스캐닝 전자 현미경 비교

레이저 스캐닝 현미경과 스캐닝 전자 현미경은 이름은 비슷하지만 샘플의 조명 방법에 큰 차이가 있습니다.레이저 스캐닝 현미경은 여기 레이저를 사용하지만 스캐닝 전자 현미경은 그 이름에서 알 수 있듯이 전자빔으로 샘플을 조사합니다.샘플 표면에서 반사된 전자 또는 2차 전자는 샘플의 형태 또는 구성에 대한 신호를 생성하고, 이러한 신호는 검출기에 의해 수집됩니다.샘플은 진공 상태여야 하므로 스캐닝 전자 현미경은 살아 있는 샘플의 관찰에는 적용할 수 없습니다.

레이저 스캐닝 현미경 배율

레이저 스캐닝 현미경은 다양한 배율의 대물렌즈와 함께 사용할 수 있습니다.따라서 레이저 스캐닝 현미경의 최대 배율은 사용되는 대물렌즈에 따라 다릅니다.저배율 대물렌즈는 전체 조직 샘플의 구조를 캡처하는 데 적합합니다.조직을 구성하는 세포의 형태를 캡처해야 하는 경우에는 중간 배율의 대물렌즈로 충분합니다.그런 다음 고배율 대물렌즈를 사용하여 조직을 구성하는 세포 내의 미세 구조를 볼 수 있습니다.