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Notas de aplicação

Application of the Z-Drift Compensation System IX-ZDC to multidimensional cell-based assay at the single cell level


Multidimensional cell-based assay at the single cell level

A cell-based assay system that facilitates efficient multi-sample data collection enables researchers to observe dose-dependent physiological activity at the single-cell level to study physiological reactions and cell response. In this type of assay, cells are typically cultured in a multiwell plate. Inverted microscopes are then used to observe physiological reactions of how cells respond when different doses of drugs are added to an individual well.

Inverted microscopes with z-drift compensation systems can perform fully automated, continuous observation  over several days, which is important for monitoring cell growth or testing the toxicity of drugs. The ability to image multidimensional drug dose-dependent cell growth and intracellular physiological activity is important for advancing cell-based assays.

Using the IX-ZDC z-drift compensator to help analyze resistance of cancer cells to MEK inhibitors using FRET biosensor

1)Visualization of extracellular signal-regulated kinases (ERKs) using Förster resonance energy transfer (FRET) biosensor

The Ras-Raf-MEK-ERK signaling pathway is well known for its association with cancer development and is a target for molecular chemotherapy drugs. However, the pathway’s association with anticancer drug resistance is unclear. In order to better understand the role of the Ras-Raf-MEK-ERK signaling pathway in anticancer drug resistance, researchers at the Graduate School of Medicine, Kyoto University, Japan analyzed resistance to MEK inhibitors in multiple cancer cell lines using a FRET biosensor that enables researchers to visualize the activity of the ERK protein kinase, which is a component of the Ras-Raf-MEK-ERK signaling pathway.

Fig 1. Structure of the FRET biosensor for visualization of ERK or S6K activity

Fig 1. Structure of the FRET biosensor for visualization of ERK or S6K activity
Phosphorylation of ERK or S6K substrate in the FRET biosensor molecule causes it to intra-molecularly bind to the phosphopeptide-binding domain (WW or FHA1) resulting in an increase in the FRET efficiency between the cyan fluorescent protein (CFP) and yellow fluorescent protein (YFP).

2)Using the IX-ZDC z-drift compensator to construct a multidimensional cell-based assay system

HT-29 cells (with BRAF V600E mutation) expressing FRET (Fig. 1) were cultured in a 96-well glass plate. After adding different doses of an MEK1/2 inhibitor (AZD6244) to individual wells, a fully-motorized, inverted Olympus IX Series microscope was used to continually observe the change in intracellular ERK activity and cell growth in each well for 3 days. The IX-ZDC z-drift compensator automatically adjusted the focus each time one of the wells was imaged, enabling researchers to capture images that were always in focus, even during long-term observation.

Fig 2. Using the IX-ZDC Z-drift compensator with a multidimensional cell-based assay system
Fig 2. Using the IX-ZDC Z-drift compensator with a multidimensional cell-based assay system
Bright spots in the images correspond to the nuclei of cells expressing the FRET biosensor for detecting ERK activity.
The warmer and cooler colors indicate higher and lower levels of ERK activity, respectively.

3)Quantitative analysis of MEK1/2 inhibitor dose-dependent ERK activity and cell growth rate

In order to analyze the dose-dependent response of HT-29 cells (with BRAF V600E mutation) to the MEK1/2 inhibitor (AZD6244) from the data obtained by the multidimensional cell-based assay described above (Fig. 2), the researchers generated a graph (Fig. 3) by plotting the MEK1/2 inhibitor (AZD6244) concentration on the x-axis, growth rate (/day) on the left y-axis, and ERK activity on the right y-axis (using a data set generated up to one day after the addition of the MEK1/2 inhibitor). To analyze the relationship between the MEK1/2 inhibitor dose-dependent ERK activity and the growth rate, they generated a second graph (Fig. 4) by plotting the ERK activity on the x-axis and growth rate on the y-axis. These graphs revealed that HT-29 cells exhibited almost identical IC50 values for both ERK activity and cell growth rate and that there was a linear correlation between ERK activity and cell growth rate.
 

Fig 3. Dose-dependent response of ERK activity and cell growth rate on the MEK1/2 inhibitor (AZD6244) in HT-29 cellsFig 4. Relationship between the MEK1/2 inhibitor (AZD6244) dose-dependent ERK activity and cell growth rate in HT-29 cells

Fig 3. Dose-dependent response of ERK activity and cell growth rate on the MEK1/2 inhibitor (AZD6244) in HT-29 cells

Fig 4. Relationship between the MEK1/2 inhibitor (AZD6244) dose-dependent ERK activity and cell growth rate in HT-29 cells

4)MEK1/2 inhibitor dose-dependent ERK activity and cell growth rate in multiple cancer cell lines

By repeating the same analysis in cancer cell lines other than HT-29 cells, researchers found that the IC50 values of the MEK1/2 for ERK activity were similar to each other in various cancer cell lines (~0.01 μM); and in MEK1/2 resistant cancer cell lines (KRas-mutant cell lines), the IC50 for the cell growth rate was more than 10 times higher than the IC50 for ERK activity, resulting in a nonlinear correlation between ERK activity and cell growth rate.

This study required large volumes of imaging data, and the efficient analysis of resistance to the MEK inhibitor in cancer cells would not have been possible without the IX-ZDC z-drift compensator for the inverted IX Series microscope.

Fig 5. Comparison of IC50 values of the MEK1/2 inhibitor (AZD6244) for ERK activity and cell growth rates in multiple cancer cell lines

Fig 5. Comparison of IC50 values of the MEK1/2 inhibitor (AZD6244) for ERK activity and cell growth rates in multiple cancer cell lines

Imaging conditions
Microscope: Motorized inverted IX Series microscope.
Z-drift compensation system: IX-ZDC
Objective: UPLSAPO20X, dry
Microplate: 96-well glass microplate

Conclusion
IX-ZDC z-drift compensator supports multidimensional cell-based assays

Olympus’ IX-ZDC z-drift compensator and the motorized, inverted IX Series microscope enable the material in individual wells within a microplate to be imaged clearly for experiments lasting multiple days. With the autofocus function, a 96-well plate can be completely imaged in about 2 minutes,* supporting a highly precise and rapid cell-based assay.

*For serial imaging of one spot in each well of a 96-well plate with a 30 ms exposure time.

Movie of UCPLFLN20XPH to multidimensional cell-based assay at the single cell level

This application note was prepared with the help of:
Dr. Naoki Komatsu, Assistant Professor, Laboratory of Bioimaging and Cell Signaling, Graduate School of Biostudies, Kyoto University, Japan and Dr. Kazuhiro Aoki, Designated Associate Professor, Imaging Platform for Spatio-Temporal Information, Graduate School of Medicine, Kyoto University, Japan.

For more details on the study in this application note, please see:
Komatsu, N., Y. Fujita, M. Matsuda, and K. Aoki. "mTORC1 upregulation via ERK-dependent gene expression change confers intrinsic resistance to MEK inhibitors in oncogenic KRas-mutant cancer cells." Oncogene 34, no. 45 (2015): 5607–5616

Produtos usados nesta aplicação

Microscópio confocal de superresolução com disco giratório

SpinSR10

  • Live cell super resolution imaging
  • Observation at depth
  • A flexible system that helps simplify your research
O sistema de microscópio invertido totalmente motorizado e automatizado

IX83

  • Unique deck system
  • Fully-motorized system
  • System solutions
Sistema de microscópio para imagem de células vivas

IXplore Live

  • Use o controlador em tempo real da Olympus para dados fisiologicamente relevantes com perturbação mínima das células 
  • Mantenha a viabilidade das células durante a formação de imagem com várias opções de controle ambiental
  • Mantenha o foco de forma precisa e fiável em experimentos de intervalo de tempo com o sistema de focagem automática do hardware da Olympus (compensação do desvio Z)
  • Descubra a forma real de suas células com a óptica de imersão de silicone da Olympus
Sistema de Microscópio Automatizado

IXplore Pro

  • Observação multidimensional automatizada com configuração simples de experimentos
  • Aumente suas estatísticas com o rastreamento de placas multipoços
  • Adquira imagens panorâmicas de fluorescência de amostras grandes, como pedaços de cérebro
  • Aumente a resolução e crie seções ópticas com deconvolução
  • Create 3D optical sections and enhance resolution with TruSight
Sistema de microscópio de imagem confocal

IXplore Spin

O sistema IXplore Spin conta com uma unidade confocal de disco giratório que possibilita uma aquisição de imagem 3D rápida, um grande campo de visão e uma viabilidade celular prolongada em experimentos de lapso de tempo. Os pesquisadores podem usá-lo para executar a formação de imagem confocal 3D rápida com alta resolução e contraste em profundidades maiores para a formação de imagem em amostras mais grossas. O disco giratório também ajuda a reduzir o fotobranqueamento e a fototoxicidade das amostras quando excitadas.

  • O controlador em tempo real (U-RTCE) ajuda a otimizar a velocidade e a precisão do dispositivo durante a aquisição automatizada
  • O sistema de compensação de desvio Z TruFocus™ mantém o foco em cada quadro
  • Imagens 3D precisas com coleta de luz aprimorada usando objetivas X Line™
  • Faça um upgrade para o sistema de super-resolução IXplore SpinSR conforme a sua pesquisa avança
Sistema de microscópio de Superresolução

IXplore SpinSR

O sistema IXplore SpinSR é o nosso microscópio confocal de super-resolução otimizado para a formação de imagem 3D de espécimes de células vivas. Assim como o sistema IXplore Spin, ele conta com um sistema de disco giratório para proporcionar uma formação de imagem 3D rápida ao mesmo tempo que limita a fototoxicidade e o branqueamento. No entanto, ele alcança imagens de super-resolução de até 120 nm XY e permite trocar entre campo amplo, confocal e super-resolução com apenas um clique.

  • Formação de imagem de super-resolução nítida e clara de até 120 nm XY, graças à Super-resolução da Olympus (OSR)
  • Viabilidade celular prolongada na formação de imagem de lapso de tempo confocal devido à menor fototoxicidade e branqueamento
  • Use duas câmeras simultaneamente para obter uma formação de imagem de super-resolução bicolor rápida
  • Formação de imagem de super-resolução com as primeiras objetivas planas apocromáticas do mundo com uma abertura numérica (AN) de 1,5*
* Em novembro de 2018. De acordo com a pesquisa da Olympus.
Sistema de microscópio para reflexão interna total (TIRF)

IXplore TIRF

Para experimentos de dinâmica de membrana, detecção de molécula única e colocalização, o sistema IXplore TIRF possibilita a formação de imagem TIRF (fluorescência de reflexão interna total) multicolorida simultânea e sensível de até quatro cores. O sistema cellTIRF da Olympus fornece um controle de ângulo do laser individual motorizado e estável, proporcionando uma penetração de onda evanescente igual para imagens de baixo ruído e alto contraste. Nossas objetivas TIRF contam com uma alta relação sinal-ruído, alta AN e colares de correção para ajustar a espessura e a temperatura das lamínulas.

  • Colocalização exata de até quatro marcadores graças ao controle de profundidade de penetração individual
  • Aproveite ao máximo a objetiva TIRF da Olympus com a maior abertura numérica (AN) do mundo, de 1,7*
  • Configuração intuitiva de experimentos complexos com o Gerenciador de experimento gráfico (GEM), cellFRAP e U-RTCE
* Em 25 de julho de 2017. De acordo com a pesquisa da Olympus.
Objetivas semiapocromáticas para cultura em recipientes

UCPLFLN/LUCPLFLN

Possibilitando a observação de culturas de tecidos através de frascos e placas, essas objetivas semiapocromáticas universais apresentam uma longa distância de trabalho e alto contraste e resolução. Fornecendo imagens niveladas e uma alta transmissão até a região do NIR, elas são adequadas para observações de campo claro, DIC e de fluorescência.

  • Objetivas universais de longa distância de trabalho e com excelente contraste e resolução nas observações de campo claro, DIC e fluorescência
  • Exibem imagens niveladas de fatores de alta transmissão até a região do infravermelho próximo do espectro
  • Dedicadas a observações de culturas de tecidos através de frascos e placas
Compensador de desvio Z

IX3-ZDC2

  • Sempre em foco
  • Desenvolvido para fácil utilização
  • Dedicado à formação de imagem de células vivas
  • Formação de imagem de várias áreas de alta precisão com o software cellSens

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