Observação 3D de fígado de rato clarificado usando o microscópio FLUOVIEW FV3000

O objetivo do experimento foi medir quantitativamente o comprimento e a espessura dos ramos das estruturas da árvore biliar em fígados de rato com lesões. A objetiva seca de 20x foi usada para a triagem inicial de amostras no FV3000 para obter imagens tomográficas consecutivas e de campo de visão amplo do tecido biliar (verde, marcador de células epiteliais biliares CK19) em amostras de tecido de fígado clarificadas com espessura de 200 µm. Esta configuração permitiu a observação quantitativa eficaz de várias amostras, possibilitando também a detecção rápida da amostra para examinar em uma resolução superior. Na imagem acima, a barra de escala representa 100 µm.

Rato de controle

Rato Klf5-LKO

Filme: estrutura da árvore biliar do rato de controle

Para obter imagens tridimensionais em uma resolução superior, o microscópio FV3000 e a objetiva de imersão em óleo de silicone de 30x da Olympus foram usados para obter imagens tomográficas consecutivas (intervalo axial Z de 1 µm) do tecido biliar (verde, marcador de células epiteliais biliares CK19) em tecido de fígado com espessura de 200 µm clarificado usando SeeDB. Essa combinação permitiu a observação em alta resolução das árvores biliares do rato de controle e do rato Klf5-LKO, mantendo um campo de visão amplo. No rato Klf5-LKO, os pesquisadores observaram aglomerados celulares CK19+ (seta branca) espacialmente separados da árvore biliar.

Dr. Hajime Okada

Neste experimento, analisamos estruturas 3D de árvores biliares relacionadas com a remodelação do fígado após uma dieta indutora de lesões no fígado. A estrutura biliar em tecidos de fígado clarificados em ratos Klf5-LKO e em ratos de controle foi comparada usando um microscópio FV3000. O detector altamente sensível do microscópio permitiu a aquisição de imagens de campo de visão amplo de alta de resolução e brilho, bem como observações rápidas com menos imagens e cálculos da média, resultando em um número elevado de imagens que pode ser usado para análise quantitativa. Além disso, a objetiva de imersão em óleo de silicone da Olympus possibilitou a aquisição de imagens em profundidade com alta resolução, permitindo-nos encontrar aglomerados celulares CK19+ espacialmente separados da árvore biliar. Esses resultados sugerem que a estrutura biliar na remodelação do tecido subordinada a várias condições de lesões no fígado pode ser regulada por alguns mecanismos moleculares.

Dr. Tohru Itoh
Professor associado do projeto

Até agora, a pesquisa médica e bioquímica acerca do fígado baseou-se, maioritariamente, em métodos de observação 2D convencionais usando seções de tecido, em vez de órgãos inteiros e intactos. Contudo, usando esses métodos, é desafiador detectar e compreender as “verdadeiras cores” do fígado sujeito a condições fisiológicas e a várias condições de doenças hepáticas.

O nosso grupo de pesquisa desenvolveu uma nova tecnologia de visualização para coloração e clarificação de tecidos do fígado, com a qual a observação 3D da estrutura biliar em fígados de rato intactos foi realizada com êxito pela primeira vez. Essa combinação da tecnologia de clarificação e de coloração permitiu-nos detectar alterações estruturais na dinâmica biliar (remodelação biliar) e realizar uma pesquisa sobre seus mecanismos regulatórios e funções fisiológicas. Nos experimentos apresentados acima, estabelecemos com êxito um sistema experimental para a visualização eficaz de uma estrutura biliar 3D usando o reagente de clarificação SeeDB e um microscópio confocal. Usando um microscópio FV3000, foram clarificados alguns mecanismos moleculares de remodelação biliar.

Com as técnicas aqui apresentadas, um microscópio confocal é útil para a análise 3D das alterações dinâmicas de vários tecidos e células do fígado, incluindo a estrutura biliar. Esperamos que a nossa nova tecnologia de visualização possa contribuir para o desenvolvimento de diagnósticos e de terapias para doenças hepáticas e medicina regenerativa, por meio de uma melhor compreensão do processo de desenvolvimento e regeneração do ponto de vista da remodelação tecidual e interações intercelulares.

2) Referências:
H. Okada, M. Yamada, K. Kamimoto, CY. Kok, K. Kaneko, M. Ema, A. Miyajima e T. Itoh, “The transcription factor Klf5 is essential for intrahepatic biliary epithelial tissue remodeling after cholestatic liver injury,” J Biol Chem., 27 de abril de 2018; 293(17):6214-6229, doi: 10.1074/jbc. RA118.002372, Epub 09 de março de 2018.

K. Kamimoto, K. Kaneko, CY. Kok, H. Okada, A. Miyajima e T. Itoh, “Heterogeneity and stochastic growth regulation of biliary epithelial cells dictate dynamic epithelial tissue remodeling,” Elife, 19 de julho de 2016; 5, pii: e15034, doi: 10.7554/eLife.15034.

K. Kaneko, K. Kamimoto, A. Miyajima e T. Itoh, “Adaptive remodeling of the biliary architecture underlies liver homeostasis,” Hepatology, junho de 2015;61(6):2056-66, doi: 10.1002/hep.27685, Epub 22 de abril de 2015.