Formação de imagens de Localização intracelular de interações proteína-proteína usando a tecnologia NanoBiT®

Uma interação proteína-proteína (PPI) é o contato físico direto entre duas proteínas. Considerando que as proteínas realizam a maior parte dos processos celulares e raramente trabalham sozinhas, estudar as interações das proteínas em pares ou grupos maiores é importante em vários campos de pesquisa, como desenvolvimento de medicamentos e pesquisa de doenças. Há vários métodos para monitorar as interações proteína-proteína sem usar células, mas esses modelos não refletem precisamente o ambiente intracelular. Além disso, alguns métodos de monitoramento de PPI que usam células exigem lise e dispositivos especializados para detecção quantitativa.

Para superar esses desafios, a Promega desenvolveu o NanoLuc^® Binary Technology (NanoBiT^®). O NanoBiT^® é um sistema de informação de complementação estrutural que pode ser usado para detecção intracelular de PPIs. Ele tem sido usado com sucesso em vários campos de pesquisa, como triagem de drogas, análise de transdução de sinais e análise de mecanismos de infecção viral.

O sistema é composto por um grande BiT (LgBiT; 17,6 kDa) e uma subunidade de pequeno BiT (SmBiT; 11 aminoácidos), que são fundidos às proteínas de interesse. Essas subunidades são expressas na célula, por isso, apenas a PPI-alvo faz com que as subunidades formem uma enzima funcional que gera um sinal de luminescência forte (Figura 1).

Figura 1. Visão geral do sistema de interação proteína-proteína do NanoBiT^®.
Imagem cortesia da Promega.
 

Formação de imagens da localização intracelular do NanoBiT

Para executar expressão citosólica e nucleica, foi feita a transfecção de dois tipos de pares de vetores em células HeLa. O primeiro par era um vetor de controle FKBP-SmBiT que não era o alvo e o vetor de controle FRB-LgBiT. O segundo par era um vetor de controle NLS¹-FKBP-SmBiT visado no núcleo e o vetor de controle FRB-LgBiT (Figura 2). O FKBP e o FRB são conhecidos por se ligarem sob tratamento de rapamicina.

Figura 2. Localização intracelular do FKBP/FRB NanoBiT e do NLS-FKBP/FRB NanoBiT.
 

A bioluminescência das células HeLa que expressam NanoBiT foi então capturada em uma imagem usando o IXplore™ Live para sistema de microscópio por luminescência². Para confirmar a localização do núcleo, foi usado o corante de contraste Hoechst33342 nas células HeLa e a imagem foi capturada no mesmo microscópio com fluorescência (Figura 3).

Observamos que o sinal de bioluminescência nas células HeLa que receberam o FKBP/FRB NanoBiT não alvo estava disperso ao longo do citosol. No entanto, confirmamos que a bioluminescência do NLS-FKBP/FRB NanoBiT estava no núcleo, dada a sua sobreposição com o corante de fluorescência Hoechst33342.

Figura 3. Localização intracelular do FKBP/FRB NanoBiT e do NLS-FKBP/FRB NanoBiT.
 

Condições experimentais:

• Microscópio: sistema de microscópio IXplore Live for Luminescence ²
• Câmera: imagEM EM-CCD (Hamamatsu Photonics)
• Objetiva: LUCPLFLN60XPH
• Lentes de imagem: 0,35X
• Ganho EM: 1200
• Concentração de furimazina: diluição de 1/200
• Concentração final de rapamicina: 30 nM
• Tempo de exposição: contraste de fase 50 ms / Bioluminescência 3 min / Fluorescência 100 ms

A Figura 4 mostra a mudança na bioluminescência do NLS-FKBP/FRB NanoBiT antes e depois da estimulação da rapamicina. A intensidade da bioluminescência no núcleo aumentou depois da estimulação da rapamicina. Esses resultados mostram que FKBP e FRB se ligam no núcleo sob tratamento da rapamicina, e a interação induziu a bioluminescência do NanoLuc. A imagem microscópica permitiu a observação da interação do FKBP e FRB induzida pela estimulação da rapamicina, conforme as mudanças na intensidade da bioluminescência citosólica e nucleica na célula viva.

Figura 4. Mudança na intensidade da bioluminescência do NLS-FKBP/FRB pela estimulação da rapamicina.
 

Condições experimentais:

• Vetores: NLS-FKBP-SmBiT/FRB-LgBit (50 ng cada)
• Microscópio: sistema de microscópio IXplore Live for Luminescence ²
• Câmera: imagEM EM-CCD (Hamamatsu Photonics)
• Ganho EM: 1200
• Objetiva: UPLFLN40XPH
• Lentes de imagem: 0,35X
• Tempo de exposição: contraste de fase 50 ms / Bioluminescência 30 s / Fluorescência 100 ms
• Intervalo de lapso de tempo: 40 s

Detecção de PPI usando um luminômetro e microscopia de luminescência

As tecnologias NanoBiT e HiBiT³ permitem detectar PPIs de alto rendimento com um luminômetro, enquanto a formação de imagem microscópica dessas tecnologias permite visualizar a localização intracelular dessas PPIs.

Combinar um luminômetro com um microscópio de luminescência dedicado para detecção de PPI oferece várias vantagens. Ao observar as PPIs que ocorreram localmente ou mudanças na localização intracelular, podemos confirmar a precisão da localização com a formação de imagem microscópicas antes de fazer uma medição de alto rendimento com um luminômetro. Esse sistema elimina a necessidade de formação de imagem de fluorescência para confirmar a localização intracelular. Podemos usar a mesma linhagem celular construída que expressa NanoBiT e HiBiT para verificar a localização intracelular e a detecção do luminômetro de alto rendimento.

Autor

Taro Hayashi
Pesquisador, engenharia biológica, engenharia óptica avançada, pesquisa e desenvolvimento, Evident

^1. Sinal de localização do núcleo (usamos 3 vezes o sinal repetido de localização do núcleo).

^2. Sistema de formação de imagem de bioluminescência com base no microscópio IXplore Live. O sistema foi projetado usando os resultados conjuntos do Professor Nagai da Universidade de Osaka, Japão, Tokai Hit., Co, Ltd. e da Evident. Esse trabalho foi feito sob o programa da Agência de Ciência e Tecnologia do Japão para desenvolver sistemas avançados de medição e análise.

^3. Tecnologia HiBiT para detectar proteínas-alvo por meio de luminescência com um marcador de peptídeo de 11 aminoácidos (HiBiT) e um fragmento de luciferase NanoLuc de 18 kDa (LgBiT).