Evident LogoOlympus Logo
Notas de aplicação

Application of silicone immersion objectives to long-term 3D live-cell imaging of mouse embryo during development


Long-term 3D live-cell imaging of a mouse embryo during development

Advances in microscopy have revealed numerous phenomena that occur during embryonic development, and this has become a major research focus in the field of developmental biology. In particular, as confocal microscopes have come into more general use, this has enabled researchers to obtain sharp three-dimensional fluorescence images of proteins, DNA, and other molecules in the zygote and of individual cells during embryonic development.
With research in this area making rapid progress, confocal microscopy is being used for prolonged 3D live-cell imaging to capture dynamic change over time as well as for three-dimensional fluorescence imaging. Olympus developed silicone immersion objectives that enable high-contrast[PG1] , long-term 3D live-cell imaging.
This application note introduces an example of high-contrast 3D live-cell imaging during the in vitro development of a mouse embryo from the zygote to blastocyst stage over approximately 4 days using a silicone immersion objective.
This application note is based on a study conducted by Dr. Kazuo Yamagata, Associate Professor in the Department of Genetic Engineering, Faculty of Biology-Oriented Science and Technology at Kinki University and his collaborators that was published in Stem Cell Reports in June 2014.

The use of silicone immersion objectives for long-term 3D live-cell imaging of a MethylRO mouse early embryo during preimplantation development

1)Creating MethylRO mice to visualize epigenetic changes in living cells

Researchers generated a fluorescent probe by fusing a red fluorescent protein to the methyl-CpG binding domain (MBD) of methyl-CpG binding domain protein 1 (MBD1), which recognizes methylated DNA. They then inserted the gene by targeting the ROSA26 locus, which is known for its ubiquitous gene expression, and generated the MethylRO mouse, a genetically modified mouse strain expressing this probe throughout the entire body.

Figure 1. Neonate MethylRO mouse for visualization of methylated DNA (yellow arrows). When irradiated with the excitation light, the entire body glows red through a filter (right panel).
Figure 1. Neonate MethylRO mouse for visualization of methylated DNA (yellow arrows).
When irradiated with the excitation light, the entire body glows red through a filter (right panel).

2)Long-term 3D live-cell imaging of an early embryo during preimplantation development using a 60X silicone immersion objective

Dr. Yamagata and his collaborators used a confocal microscope for time-lapse 3D live-cell imaging of cells from a MethylRO mouse (Fig. 1) during early development of the preimplantation embryo over approximately 4 days.
The researchers used an Olympus silicone immersion objective designed for live cell observation. Silicone oil has a refractive index (ne≈1.40) close to that of living tissue (ne≈1.38). Spherical aberration, which occurs with oil or water immersion objectives due to a refractive-index mismatch with biological samples, is reduced in silicone immersion objectives, allowing researchers to achieve deep, high-contrast fluorescence imaging at a greater depth. In addition, silicone oil does not dry out or become solid, compared to water or oil immersion, when used in a warm (37 °C) environment over 4 days, thereby supporting long-term, stable high-resolution 3D live-cell imaging.
Dr. Yamagata’s team previously used an oil lens and water immersion objective, the former standard for deep observation in live-cell imaging. By switching to a silicone immersion objective, the researchers were able to view fluorescently labeled methylated DNA (mCherry-MBD-NLS) within the nuclei from the surface to the inner region over approximately 4 days from the one-cell zygote to blastocyst stage.

Figure 2. Live-cell imaging of a MethylRO embryo during pre-implantation development. Changes in methylated DNA (mCherry-MBD-NLS) within the nuclei were observed over approximately 4 days.
Figure 2. Live-cell imaging of a MethylRO embryo during pre-implantation development.
Changes in methylated DNA (mCherry-MBD-NLS) within the nuclei were observed over approximately 4 days.

Movie1. Time-lapse imaging over 82 hours of changes in methylated DNA in the nuclei (red: mCherry-MBD-NLS) and cells (green: CAG-EGFP).
Activation of embryonic genes (red) started from the two-cell stage in approximately 21 hours from the beginning of observation.

Movie2. Three-dimensional image of methylated DNA (mCherry-MBD-NLS) within nuclei of a blastocyst

Figure 2 and Movie 1 above show that fluorescence photobleaching during long-term imaging was negligible, enabling clear imaging of methylated DNA within the nuclei. In Movie 2, a three-dimensional image of the entire 100 mm blastocyst was successfully obtained using an objective with both a high numerical aperture (1.3) and long working distance (0.3 mm)

Conclusion: The use of silicone immersion objectives is essential for the realization of deep, high-contrast 3D live-cell imaging over long periods of time.

Olympus’ line-up of 30/40/60/100X silicone immersion objectives offers both high numerical aperture (NA) and long working distance. Since the refractive index of silicone oil (ne≈1.40) is close to that of living tissue (ne≈1.38), spherical aberration induced by a refractive-index mismatch is reduced when observing thick tissues, thereby enabling high-resolution imaging. In addition, silicone oil does not dry out so there is no need to add more immersion liquid during an experiment. The silicone immersion objectives are compatible with the IX motorized inverted microscope series’ Z-Drift Compensation System IX-ZDC. With this system, researchers can obtain images that are constantly in focus and unaffected by temperature changes during long-term observation. In addition, the refractive index of silicone oil (ne≈1.40) and that of SCALEVIEW-A2 (ne≈1.38), an optical clearing agent supplied by Olympus, are comparable, minimizing refractive index mismatch when using this reagent. Silicone immersion objectives with high NA provide optimum performance when optically cleared specimens are used.

Imaging conditions
Imaging system: Research inverted microscope IX series
Objective: silicone immersion objective UPLSAPO60XS
Confocal scanner unit: CSU-X1 (Yokogawa Electric Corporation)
EMCCD camera: iXON3 DU897E-CS0 (Andor Technology)

This application note was prepared with the help of
Dr. Kazuo Yamagata, Associate Professor, Department of Genetic Engineering, Faculty of Biology-Oriented Science and Technology, Kinki University

For more details on the studies in this application note, please refer to the article below:

Ueda, Jun, Kazumitsu Maehara, Daisuke Mashiko, Takako Ichinose, Tatsuma Yao, Mayuko Hori, Yuko Sato, Hiroshi Kimura, Yasuyuki Ohkawa, and Kazuo Yamagata. "Heterochromatin dynamics during the differentiation process revealed by the DNA methylation reporter mouse, MethylRO." Stem cell reports 2, no. 6 (2014): 910-924.

Produtos usados nesta aplicação

Microscópio confocal de superresolução com disco giratório

SpinSR10

  • Live cell super resolution imaging
  • Observation at depth
  • A flexible system that helps simplify your research
O sistema de microscópio invertido totalmente motorizado e automatizado

IX83

  • Unique deck system
  • Fully-motorized system
  • System solutions
Sistema de microscópio para imagem de células vivas

IXplore Live

  • Use o controlador em tempo real da Olympus para dados fisiologicamente relevantes com perturbação mínima das células 
  • Mantenha a viabilidade das células durante a formação de imagem com várias opções de controle ambiental
  • Mantenha o foco de forma precisa e fiável em experimentos de intervalo de tempo com o sistema de focagem automática do hardware da Olympus (compensação do desvio Z)
  • Descubra a forma real de suas células com a óptica de imersão de silicone da Olympus
Sistema de Microscópio Automatizado

IXplore Pro

  • Observação multidimensional automatizada com configuração simples de experimentos
  • Aumente suas estatísticas com o rastreamento de placas multipoços
  • Adquira imagens panorâmicas de fluorescência de amostras grandes, como pedaços de cérebro
  • Aumente a resolução e crie seções ópticas com deconvolução
  • Create 3D optical sections and enhance resolution with TruSight
Sistema de microscópio de imagem confocal

IXplore Spin

O sistema IXplore Spin conta com uma unidade confocal de disco giratório que possibilita uma aquisição de imagem 3D rápida, um grande campo de visão e uma viabilidade celular prolongada em experimentos de lapso de tempo. Os pesquisadores podem usá-lo para executar a formação de imagem confocal 3D rápida com alta resolução e contraste em profundidades maiores para a formação de imagem em amostras mais grossas. O disco giratório também ajuda a reduzir o fotobranqueamento e a fototoxicidade das amostras quando excitadas.

  • O controlador em tempo real (U-RTCE) ajuda a otimizar a velocidade e a precisão do dispositivo durante a aquisição automatizada
  • O sistema de compensação de desvio Z TruFocus™ mantém o foco em cada quadro
  • Imagens 3D precisas com coleta de luz aprimorada usando objetivas X Line™
  • Faça um upgrade para o sistema de super-resolução IXplore SpinSR conforme a sua pesquisa avança
Sistema de microscópio de Superresolução

IXplore SpinSR

O sistema IXplore SpinSR é o nosso microscópio confocal de super-resolução otimizado para a formação de imagem 3D de espécimes de células vivas. Assim como o sistema IXplore Spin, ele conta com um sistema de disco giratório para proporcionar uma formação de imagem 3D rápida ao mesmo tempo que limita a fototoxicidade e o branqueamento. No entanto, ele alcança imagens de super-resolução de até 120 nm XY e permite trocar entre campo amplo, confocal e super-resolução com apenas um clique.

  • Formação de imagem de super-resolução nítida e clara de até 120 nm XY, graças à Super-resolução da Olympus (OSR)
  • Viabilidade celular prolongada na formação de imagem de lapso de tempo confocal devido à menor fototoxicidade e branqueamento
  • Use duas câmeras simultaneamente para obter uma formação de imagem de super-resolução bicolor rápida
  • Formação de imagem de super-resolução com as primeiras objetivas planas apocromáticas do mundo com uma abertura numérica (AN) de 1,5*
* Em novembro de 2018. De acordo com a pesquisa da Olympus.
Sistema de microscópio para reflexão interna total (TIRF)

IXplore TIRF

Para experimentos de dinâmica de membrana, detecção de molécula única e colocalização, o sistema IXplore TIRF possibilita a formação de imagem TIRF (fluorescência de reflexão interna total) multicolorida simultânea e sensível de até quatro cores. O sistema cellTIRF da Olympus fornece um controle de ângulo do laser individual motorizado e estável, proporcionando uma penetração de onda evanescente igual para imagens de baixo ruído e alto contraste. Nossas objetivas TIRF contam com uma alta relação sinal-ruído, alta AN e colares de correção para ajustar a espessura e a temperatura das lamínulas.

  • Colocalização exata de até quatro marcadores graças ao controle de profundidade de penetração individual
  • Aproveite ao máximo a objetiva TIRF da Olympus com a maior abertura numérica (AN) do mundo, de 1,7*
  • Configuração intuitiva de experimentos complexos com o Gerenciador de experimento gráfico (GEM), cellFRAP e U-RTCE
* Em 25 de julho de 2017. De acordo com a pesquisa da Olympus.
Objetivas superapocromáticas

UPLSAPO-S/UPLSAPO-W

Essas objetivas superapocromáticas fornecem compensação da aberração cromática e esférica e alta transmissão da faixa visível ao infravermelho próximo. Usando um meio de imersão de óleo de silicone ou água, que têm índices de refração que correspondem aproximadamente ao das células vivas, elas obtêm uma formação de imagem de alta resolução no interior de tecidos vivos. 

  • Compensam as aberrações esféricas e cromáticas e alta transmissão da faixa visível até a região do infravermelho próximo
  • O meio de imersão de óleo de silicone ou água ajuda a obter a formação de imagem de alta resolução no interior de tecidos vivos e reduz a aberração esférica, pois seus índices de refração correspondem aproximadamente ao das células vivas

foi adicionado com sucesso aos seus favoritos

Visualizar favoritosFechar

Maximum Compare Limit of 5 Items

Please adjust your selection to be no more than 5 items to compare at once

Sorry, this page is not
available in your country.

Desculpe, esta página não está disponível em seu país