Monitoramento de todo o processo de diferenciação de organoides hepáticos derivados de células iPS humanas usando o sistema de monitoramento de incubação CM20

Introdução

Recentemente, fez-se um rápido progresso no estabelecimento in vitro de tecidos/órgãos em miniatura, chamados organoides, a partir de células-tronco pluripotentes humanas, incluindo células-tronco pluripotentes induzidas (iPS). Os organoides humanos oferecem oportunidades únicas para uma grande variedade de campos, desde a biologia básica do desenvolvimento até a modelagem de doenças e o desenvolvimento de medicamentos.

Contexto experimental

Em geral, os organoides são formados por meio de auto-organização, na qual as células componentes são dispostas espacialmente em locais apropriados para determinar seus destinos de diferenciação em tipos celulares específicos, levando eventualmente à expressão de funções orgânicas. O processo de derivar células iPS humanas indiferenciadas para os organoides de um órgão alvo requer um longo intervalo de tempo, pelo menos um mês. A longa duração se deve à existência de vários estágios de células diferenciadas intermediárias correspondentes aos estágios de desenvolvimento. Em muitos casos, esses processos também incluem as etapas de incorporação das células em uma matriz extracelular que contém componentes da membrana basal que é essencial para a polarização das células e posterior manutenção das estruturas tridimensionais. Em outras palavras, a geração de organoides com sucesso e reprodutibilidade de uma certa qualidade a partir de células iPS humanas inevitavelmente exige um exame cuidadoso das condições de cultura bidimensional e tridimensional. Mais especificamente, além do controle de qualidade das células iPS, é importante monitorar perfeitamente os processos de diferenciação por um longo intervalo de tempo, incluindo a coleta de dados sobre comportamentos tridimensionais e morfogênese de populações de células.

Nesta nota de aplicação, tentamos observar o processo de diferenciação usando o sistema de monitoramento de incubação Olympus Provi CM20. Usamos nosso método publicado recentemente para gerar organoides de fígado humano^1,2 como exemplo de modelo.

Observação de alterações morfológicas durante a formação do intestino anterior posterior

Usando o sistema CM20, testamos se é possível observar alterações morfológicas tridimensionais no processo de diferenciação de células iPS humanas indiferenciadas em um endoderma definitivo bidimensional em forma de chapa e o subsequente surgimento de esferoides do intestino anterior.

Resultados

Utilizando o sistema CM20, pudemos observar não apenas o processo de manutenção da cultura de células iPS humanas, mas também sua diferenciação em endoderma definitivo e o posterior surgimento de esferoides do intestino anterior. Esses esferoides do intestino anterior foram gerados através da formação celular autônoma de agregados celulares tridimensionais derivados da cell sheet bidimensional, demonstrando que o processo de tais alterações morfológicas pode ser rastreado com o sistema CM20. Como os organoides de outros órgãos endodérmicos, como estômago e intestino, também são derivados de esferoides intestinais primitivos originados do endoderma definitivo, propomos que o sistema CM20 pode ser amplamente aplicado para monitorar o processo de diferenciação desses organoides.

Observação do processo de cultura de organoides hepáticos em Matrigel

Usando o sistema CM20^*1, testamos se é possível observar o processo de cultura de organoides hepáticos que se diferenciam e crescem em Matrigel de maneira tridimensional.

Resultados

Usando o sistema CM20, conseguimos acompanhar o processo de diferenciação de organoides hepáticos em uma cultura tridimensional usando gotas de Matrigel em uma placa de 24 poços por cerca de 2 semanas.

Conclusão

Usando os recursos de monitoramento automatizado do software do sistema CM20, é possível rastrear o processo de diferenciação que causa alterações morfológicas, bem como o processo de crescimento de organoides tridimensionais em gel de matriz extracelular. Nosso experimento mostrou que o sistema CM20 pode monitorar o processo de cultura de longo prazo, desde a manutenção e gerenciamento de células iPS humanas até sua diferenciação em organoides, e pode contribuir para a otimização e controle de qualidade das culturas de células.

Comentários do Dr. Takebe e do Dr. Yoneyama

Referências

1. Rie Ouchi, Shodai Togo, Masaki Kimura, Tadahiro Shinozawa, Masaru Koido , Hiroyuki Koike, Wendy Thompson, Rebekah A Karns, et al., “Modeling Steatohepatitis in Humans with Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids.” 2019 Aug 6;30(2):374-384.e6. doi: 10.1016/j.cmet.2019.05.007. Epub 2019 May 30. PMID: 31155493 PMCID: PMC6687537 DOI: 10.1016/j.cmet.2019.05.007
2. Tadahiro Shinozawa, Masaki Kimura, Yuqi Cai, Norikazu Saiki, Yosuke Yoneyama, Rie Ouchi, Hiroyuki Koike, Mari Maezawa, et al., “High-Fidelity Drug-Induced Liver Injury Screen Using Human Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids.” 2021 Feb;160(3):831-846.e10. doi: 10.1053/j.gastro.2020.10.002. Epub 2020 Oct 8. PMID: 33039464 PMCID: PMC7878295 (available on 2022-02-01) DOI: 10.1053/j.gastro.2020.10.002

*1 Usando recursos adicionados à versão 1.2.4 ou posterior do sistema Olympus Provi CM20. Baixe a atualização ou leia as notas de lançamento do software para obter mais detalhes.