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Notas de aplicação

Análise 3D de organoides tumorais derivados de pacientes


Foram analisadas quantitativamente imagens confocais de organoides tumorais derivados de pacientes (PDO — Patient-Derived tumor Organoids) usando o software NoviSight™ 3D para avaliar suas características morfológicas e ligação de anticorpos de medicamentos com alvo molecular.

Introdução

Os modelos de tecido 3D são populares para a descoberta de medicamentos, uma vez que simulam o microambiente in vivo. PDOs são uma das ferramentas mais poderosas para recapitular a resposta original do paciente ao medicamento. Na verdade, um estudo recente revela que os perfis fenotípicos e genotípicos dos PDOs apresentam um alto grau de semelhança com o tumor original do paciente. Principalmente, os PDO poderiam prever a reatividade a medicamentos com mais de 80% de exatidão.

Ao usar organoides tumorais derivados de pacientes de Fukushima (F-PDO®), o microscópio confocal de varredura a laser FLUOVIEW® FV3000 da Olympus e o software de análise NoviSight 3D, oferecemos um novo processo de trabalho para a morfologia do PDO e a distribuição de medicamentos.

3D Analysis of Patient-Derived Tumor Organoids

Resumo gráfico

Resumo gráfico

Benefícios

  • Gere imagens e analise PDO enquanto retém as informações em sua estrutura 3D.
  • O software NoviSight pode identificar objetos em 3D, classificar os objetos e fornecer dados estatísticos.

Métodos

Preparação de células

Para preparar as células, usamos três tipos de F-PDOs de pulmão (RLUN5, RLUN16 e RLUN21). RLUN5 foi cultivado a partir de um tumor de carcinoma adenoescamoso, enquanto RLUN16 e RLUN21 foram cultivados a partir de um tumor de carcinoma escamoso. RLUN21 forma grandes agregados de células e apresenta um citoplasma maior do que os outros (Fig.  1).

Os F-PDOs foram então centrifugados, coletados e fixados com paraformaldeído a 4% de um dia para o outro. Erbitux®, um inibidor do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR — Epidermal Growth Factor Receptor), e Herceptin®, um inibidor do receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2), foram marcados com HiLyte™ Fluor 555 (Chemical Dojin) e incubados com F-PDOs por três horas.

Figure 1 F-PDOs
Figure 1 F-PDOs

Imunocoloração e limpeza

Realizamos o protocolo de imunocoloração Hama et al. com algumas modificações (Fig.  2). Cada F-PDO fixado foi incubado de um dia para o outro com um anticorpo Ki67 (Abcam, 16667) e diluído com a solução AbScale (0,33 M de ureia e 0,2% de Triton-X100). Após lavagem com AbScale, os F-PDOs foram incubados com um segundo anticorpo por três horas e diluídos com AbScale. Após lavagem com a solução de enxágue AbScale por uma hora, os F-PDOs foram fixados novamente com paraformaldeído a 4%. Em seguida, foram lavados com uma solução salina tamponada com fosfato (PBS — Phosphate-Buffered Saline) e incubados de um dia para o outro usando o reagente de limpeza ScaleS4 com DAPI. Então, foram feitas imagens dos F-PDOs limpos com o microscópio confocal de varredura a laser FV3000 da Olympus.

Figura 2 Esquema de imunocoloração e limpeza dos F-PDOs
Figura 2 Esquema de imunocoloração e limpeza dos F-PDOs

Formação de imagem e análise

Usamos um aumento de 10× ou 30× com 2 μm de Z-pitch para capturar imagens dos F-PDOs limpos para análise 3D.
Uma configuração de Z-pitch apropriada é importante para uma análise exata de células 3D. As imagens foram então importadas para o software NoviSight™ e reconstruídas em 3D. O software NoviSight pode reconhecer objetos 3D, como um núcleo, e convertê-los em dados quantitativos.

Resultados

Quantificação 3D da morfologia dos F-PDOs

O software NoviSight nos permitiu quantificar os PDOs usando várias imagens de plano Z. Ao colorir seus núcleos, o software de análise capturou toda a estrutura e permitiu o reconhecimento de uma única célula (Fig.  3A). Ele também adicionou cada objeto reconhecido no gráfico como uma única representação gráfica. Quando o software reconheceu cada núcleo como um objeto, extraímos células Ki67 positivas tanto graficamente quanto tridimensionalmente gerando representações gráficas de alta intensidade de Ki67 (Fig.  3B). Usando esses métodos, quantificamos o número de células, o volume, a densidade celular e a proporção de células Ki67 positivas do F-PDO (Fig.  3C). Descobrimos que a proporção de células Ki67 positivas de RLUN21 era menor do que a dos outros. Além disso, o citoplasma maior RLUN21 pode ter causado sua baixa densidade celular.

A

Original RLUN21
RLUN21 original
Nuclear recognition
Reconhecimento nuclear
Nuclear recognition volume view
Visualização do volume do reconhecimento nuclear
RLUN21
RLUN21

B

Ki67 positive/negative cells were sorted by Ki67 intensity. NoviSight software can display sorted cells in a “Gallery view.”

C

Classified Ki67 positive cells can be displayed in 3D with a red circle.

D

RLUN5 RLUN16 RLUN21
número de células 926 (±719) 294 (±162) 2595 (±1480)
volume (voxels) 3.35.E+06 (±3.26.E+06) 1.08.E+06 (±6.85.E+05) 1.13.E+07 (±9.12.E+06)

Figura 3 Quantificação 3D da morfologia dos F-PDOsProporção de células Ki67 positivas
Figura 3 Quantificação 3D da morfologia dos F-PDOs

A. Três visualizações laterais originais de RLUN21, reconhecimento nuclear NoviSight 3D (visualização de três lados e do volume) e reconhecimento da estrutura do NoviSight.
B. As células Ki67 positivas/negativas foram classificadas pela intensidade de Ki67. O software NoviSight pode exibir células classificadas em uma “visualização de galeria”.
C. As células Ki67 positivas classificadas podem ser exibidas em 3D com um círculo vermelho.
D. Dados quantitativos dos F-PDOs.

Análise 3D de distribuição de medicamentos

Quando adicionamos o Erbitux ou Herceptin marcado com HyLight-555 a cada F-PDO, o Erbitux ligou-se uniformemente a RLUN21 a partir de sua superfície, enquanto o Herceptin ligou-se irregularmente a RLUN21. O módulo de reconhecimento de volume do software NoviSight™ quantificou a proporção de volume positivo do medicamento anticorpo (Fig.  4A). Em seguida, usamos o software NoviSight para quantificar a diferença nos estilos de ligação, já que ele pode modificar a região direcionada para análise. Para isso, criamos duas regiões alvo: uma região de volume reduzido a partir da superfície em uma certa porcentagem e uma região de volume de contorno com qualquer largura. Calculamos a intensidade dos medicamentos anticorpos durante os volumes. Notamos uma grande diferença quantitativa entre o volume reduzido e o volume de contorno no Erbitux, enquanto havia pouca no Herceptin. Isso significa que o Erbitux se ligou fortemente à região de contorno de RLUN21, enquanto o Herceptin se ligou a RLUN21 sem parcialidade. Este método permitiu mostrar quantitativamente a distribuição de medicamentos anticorpos.

A

 
Erbitux

RLUN5

   
 

RLUN16

 
  

RLUN21

Reconhecimento do volume de medicamentos anticorpos

Antibody drug   volume recognition

 
Herceptin

RLUN5


 

RLUN16

 
 

RLUN21

Reconhecimento do volume de medicamentos anticorpos

Antibody drug   volume recognition


 

Volume positivo de anticorpos (%)

Volume positivo de anticorpos

B

Figura 4 Quantificação 3D da distribuição de medicamentos anticorposRLUN21 Antibody intensity outside/inside region ratio
Figura 4 Quantificação 3D da distribuição de medicamentos anticorpos

A. Três imagens laterais dos F-PDOs com Erbitux ou Herceptin e reconhecimento do volume das ligações de medicamentos anticorpos do NoviSight. O gráfico mostra o volume de ligação de anticorpos no volume total.
B. Módulo de modificação da região do NoviSight. O NoviSight pode modificar a região direcionada para análise para fornecer dados quantitativos na região limitada.

Conclusão

Neste estudo, revelamos que o software NoviSight pode realizar análises quantitativas de PDOs de forma morfológica e farmacológica usando imagens capturadas pelo microscópio confocal de varredura a laser FV3000 da Olympus. Ao combinar as imagens de alta resolução do microscópio FV3000 com a alta exatidão de reconhecimento do software NoviSight, podemos produzir resultados quantitativos mais confiáveis.

Reference

  1. Vlachogiannis G et al., (2018) Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359(6378):920-926. doi: 10.1126/science.aao2774
  2. Takahashi et al., (2019) An In Vitro System for Evaluating Molecular Targeted Drugs Using Lung Patient-Derived Tumor Organoids. Cells. 8(5), 481. doi:/10.3390
  3. Tamura H, et al. Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues. Oncol Rep.,40, 635-646, 2018
  4. Hama et al., (2016) Deep Imaging of Cleared Brain by Confocal Laser-Scanning Microscopy. Nature Protocol Exchange. doi:/10.1038 Mayu

Autores

Mayu Ogawa (Olympus)

Reconhecimento

Este estudo foi apoiado pelo Professor Takagi da Fukushima Medical University. Para saber mais sobre os F-PDOs (organoides derivados de pacientes de Fukushima), visite https://www.fmu.ac.jp/home/trc/en/contract-research-provision/f-pdo/

Produtos usados nesta aplicação

Software de análise celular 3D

NoviSight

O software de análise celular NoviSight 3D fornece dados estatísticos sobre esferoides e objetos 3D em experimentos com base em microplacas. Use-o para quantificar a atividade celular em 3D, capturar facilmente eventos celulares raros, obter contagens de células precisas e melhorar a sensibilidade da detecção. O software NoviSight funciona com uma variedade de técnicas de formação de imagem, incluindo a formação de imagem confocal de rastreamento de pontos, formação de imagem de dois fótons, formação de imagem confocal de disco giratório e formação de imagem de células vivas de super-resolução.

  • Reconhecimento de imagem 3D rápido de estruturas inteiras a características subcelulares
  • Análise estatística precisa
  • Equipado com uma variedade de ensaios padrão prontos para usar ou crie o seu próprio facilmente

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