Análise de imagens fluorescentes — Divisão celular em esferoides

A divisão celular dentro dos esferoides pode ser visualizada pela coloração dos núcleos e microtúbulos das células. O número de células em mitose em esferoides pode ser avaliado quantitativamente usando imagens capturadas por um microscópio confocal a laser e o módulo de contagem do software NoviSight™.

Objetivos

O grau de malignidade do tecido canceroso é avaliado ao medir o número de células em mitose ou de células em mitose atípica. O número de células cancerosas em mitose é geralmente determinado pela citometria de fluxo. Nessa técnica, o tecido canceroso é dissociado e os núcleos tingidos para contar o número de células em mitose, independentemente de se tratar de uma cultura de células 2D ou 3D. No entanto, uma vez que a citometria de fluxo não consegue visualizar as estruturas 3D originais dos tecidos, é impossível identificar a localização das células em mitose dentro do tecido canceroso. Também é difícil analisar a relação entre as informações morfológicas, como o tamanho do tumor e a divisão celular. Neste estudo, visualizamos com sucesso as células mitóticas dentro de um esferoide tumoral intacto por meio da coloração do núcleo e do microtúbulo, seguido pela limpeza do tecido. Essa técnica, juntamente com o software NoviSight™, possibilitou a contagem do número de células em mitose. A análise quantitativa das imagens permitiu identificar a localização das células em mitose e em mitose atípica.

Preparação de amostras

Foi semeada uma suspensão de células HT-29 em uma placa PrimeSurface® 96U (SUMITOMO BAKELITE CO., LTD) a 500 células/poço. Depois de 5 dias de cultura, as células formaram uma estrutura esferoidal, e tratamos os esferoides com várias concentrações de Paclitaxel. Após a adição de Paclitaxel, os esferoides foram incubados por 48 horas e fixados com paraformaldeído a 4%. Os núcleos e microtúbulos celulares foram tingidos com Hoechst 33342 (DOJINDO) e anticorpo antitubulina conjugada com Alexa Fluor 488 (eBioscience), respectivamente. Os esferoides tingidos foram tratados com um reagente de limpeza de tecidos, ScaleS, de um dia para o outro a 37 °C.

Conclusão
Aquisição e análise de imagens fluorescentes

Foram obtidas imagens fluorescentes dos esferoides usando o microscópio confocal de varredura a laser FV3000. No grupo de controle não tratado, a formação de fusos pelos microtúbulos, uma característica específica das células em mitose, foi observada em três camadas de células da superfície esferoidal (A). O software NoviSight™ foi usado para contar o número de células em mitose nos grupos de controle e tratados com Paclitaxel (B, C). Os resultados mostram que o Paclitaxel aumentou o número de células em mitose de maneira dependente da concentração (D). Os resultados mostram claramente o efeito do Paclitaxel como um inibidor da despolimerização dos microtúbulos.

PrimeSurface é uma marca registrada da Sumitomo Bakelite Co., Ltd.
Olympus é uma marca registrada e NoviSight e Insightful Analysis, Intelligent Answers são marcas da Olympus Corporation.