Avaliar o desempenho de um medicamento usando esferoides tumorais tridimensionais é importante porque os esferoides refletem o complexo microambiente in vitro do câncer. Isso permite que os pesquisadores avaliem a eficácia de um medicamento sob parâmetros que mais se assemelham ao ambiente natural de um tumor.
Para testar a aplicabilidade do software de análise NoviSight 3D a esta aplicação, cocultivamos esferoides tumorais de células A549 e células HeLa. Em seguida, usamos o software NoviSight para analisar tridimensionalmente os efeitos do tratamento medicamentoso nessas células. Este estudo demonstrou que o software NoviSight pode ser usado com sucesso para classificar objetos de acordo com as informações que eles contêm e para analisar os parâmetros de cada um para avaliar a eficácia de um medicamento.
Células de pulmão humano A549 e células de câncer cervical HeLa (EGFP expressa no núcleo) foram misturadas em uma proporção variável. A proporção de células HeLa foi corrigida com base na intensidade dos sinais de EGFP (Fig. 1*1). As células foram semeadas em uma placa de fundo redondo de 384 poços Corning® (200 células por poço) e cultivadas por 3 dias em DMEM com FBS a 10%. A placa foi centrifugada suavemente para remover quaisquer bolhas de ar nos poços.
A549: HeLa-EGFPnls
100:0 | 75:25 | 50:50 | 25:75 | 0:100 |
Figura 1. Esferoides tumorais de cocultura preparados*1
As amostras foram tratadas com estaurosporina (STS) por 5 horas em concentrações de 3,7 nM a 3,75 μM para atingir uma proporção de 1:1 de células A549 e células HeLa nos esferoides. Usando a diferença na permeabilidade da membrana, determinamos a viabilidade celular pela coloração de todos os núcleos com 10 μM de Hoechst 33342 (DOJINDO) e dos núcleos das células mortas com 1 μM de TO-PRO3 (Thermo Fisher Scientific®). Em seguida, lavamos as amostras três vezes com 1x PBS e as fixamos com paraformaldeído a 4% de um dia para o outro a 4 °C (39,2 °F). Antes da formação de imagem, os esferoides foram tratados com o reagente de limpeza de tecidos SCALEVIEW-S4 (FUJIFILM Wako), de um dia para o outro, em temperatura ambiente.
Foram obtidas imagens fluorescentes de esferoides usando o microscópio confocal de varredura a laser FLUOVIEW® FV3000 com uma objetiva superapocromática A Line (UPLSAPO30XS). O colar de correção da objetiva foi ajustado para corresponder ao índice de refração do líquido de imersão para fornecer imagens de alta qualidade e morfologia 3D. Várias das imagens foram importadas para o software de análise celular NoviSight™ 3D, onde foram reconstruídas tridimensionalmente. O software NoviSight pode reconhecer objetos, como núcleos, e realizar várias análises dos sinais contidos nos objetos.
Tornar os esferoides transparentes e fazer imagens deles com um microscópio confocal de varredura a laser FV3000 nos permitiu obter imagens dos esferoides tumorais cocultivados em profundidade. O tratamento com estaurosporina aumentou o número de células mortas de uma maneira dependente da dose (Fig. 2*1). A análise tridimensional é necessária para determinar quais células estão mortas e quantas células mortas existem em uma massa tridimensional.
Figura 2. Resposta a medicamentos em esferoides de cocultura*1
Os sinais Hoechst 33342 nos permitiram reconhecer os núcleos. Todas as células foram classificadas em dois grupos com base na presença ou ausência de um sinal de EGFP: EGFP positiva (células HeLa) e EGFP negativa (células A549). As células nesses dois grupos foram posteriormente divididas de acordo com a presença ou ausência de sinais de células mortas (TO-PRO3, vermelho) para um total de quatro grupos (Fig. 3*1). A porcentagem de células vivas em relação ao total tanto de células A549 como de células HeLa foi calculada e representada graficamente (Fig. 4). Os resultados mostraram que as células HeLa eram mais sensíveis à estaurosporina do que as células A549.
Usando o software NoviSight™, foi possível classificar os tipos de células contidos em cada esferoide tumoral de cocultura e analisar a capacidade de resposta específica do tipo de célula ao medicamento.
Galeria | ||||
Hoechst | + | + | +*2 | +*2 |
EGFP | - | - | + | + |
TO-PRO-3 | - | + | - | + |
Figura 3. O software NoviSight pode classificar as células em 4 grupos com base nos sinais*1
*2 As duas galerias à direita não exibem os sinais Hoechst
Concentração de estaurosporina
Figura 4. Diferença na capacidade de resposta ao medicamento entre as células A549 e as células HeLa
As imagens são capturadas tridimensionalmente para que uma análise espacial mais complicada possa ser realizada. Isso permite a análise do comportamento celular em tecidos heterólogos, como o câncer. O software NoviSight™ pode definir a região a ser analisada. Configuramos o software para analisar o centro e a periferia de cada esferoide e criamos oito grupos (Fig. 5). Em seguida, realizamos uma análise populacional dentro dessas áreas (Fig. 6). Este método permite a análise espacial da eficácia de medicamentos em esferoides tumorais de cocultura.
Figura 5. Diagrama esquemático de análise espacial
Figura 6. O software NoviSight pode classificar as partes centrais e periféricas
O software NoviSight™ pode não apenas contar o número de células mortas, mas também analisar a eficácia espacial do medicamento. Para demonstrar essa funcionalidade, realizamos uma análise espacial de cada célula morta nos esferoides de cocultura. Foi calculada a proporção entre cada célula morta e o número de células nas áreas central e periférica (Fig. 7). Nesse caso, não houve diferença na eficácia do medicamento entre essas duas regiões. O número de células mortas no centro e na periferia aumentou de maneira dependente da dose.
Concentração de estaurosporina
Figura 7. Diferença na capacidade de resposta ao medicamento entre as regiões central e periférica
Usando o software NoviSight e o microscópio confocal de varredura a laser FLUOVIEW® FV3000, foi possível classificar os tipos de células contidas em esferoides tumorais de cocultura e analisar a capacidade de resposta específica do tipo de célula ao medicamento. Ao alterar a combinação de coculturas, o microambiente de vários cânceres pode ser reproduzido com sucesso e a eficácia dos medicamentos anticâncer pode ser avaliada.
Hiroya Ishihara, Tecnologia de Avaliação Biológica 2, Pesquisa e Desenvolvimento
*1 Embora tenha se tornado uma das linhagens celulares mais importantes na pesquisa médica, é importante reconhecer que a contribuição de Henrietta Lacks para a ciência aconteceu sem o seu consentimento. Essa injustiça, embora tenha levado a descobertas importantes em imunologia, doenças infecciosas e câncer, também levantou discussões importantes sobre privacidade, ética e consentimento na medicina.
Para saber mais sobre a vida de Henrietta Lacks e sua contribuição para a medicina moderna, clique aqui.
http://henriettalacksfoundation.org/
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