Análise 3D de esferoides tumorais de cocultura usando o software NoviSight™

Foram analisadas quantitativamente imagens confocais de esferoides de cocultura usando o software NoviSight para avaliar sua população de células e determinar a sensibilidade a medicamentos em cada célula.

Introdução

Avaliar o desempenho de um medicamento usando esferoides tumorais tridimensionais é importante porque os esferoides refletem o complexo microambiente in vitro do câncer. Isso permite que os pesquisadores avaliem a eficácia de um medicamento sob parâmetros que mais se assemelham ao ambiente natural de um tumor.

Para testar a aplicabilidade do software de análise NoviSight 3D a esta aplicação, cocultivamos esferoides tumorais de células A549 e células HeLa. Em seguida, usamos o software NoviSight para analisar tridimensionalmente os efeitos do tratamento medicamentoso nessas células. Este estudo demonstrou que o software NoviSight pode ser usado com sucesso para classificar objetos de acordo com as informações que eles contêm e para analisar os parâmetros de cada um para avaliar a eficácia de um medicamento.

Resumo gráfico

Benefícios

• Com base nos sinais, dois tipos de células podem ser classificados, e nós podemos realizar análises populacionais.
• A eficácia do medicamento pode ser analisada espacialmente separando as áreas central e periférica do esferoide.

Métodos

Preparação de células

Células de pulmão humano A549 e células de câncer cervical HeLa (EGFP expressa no núcleo) foram misturadas em uma proporção variável. A proporção de células HeLa foi corrigida com base na intensidade dos sinais de EGFP (Fig.  1^*1). As células foram semeadas em uma placa de fundo redondo de 384 poços Corning® (200 células por poço) e cultivadas por 3 dias em DMEM com FBS a 10%. A placa foi centrifugada suavemente para remover quaisquer bolhas de ar nos poços.

A549: HeLa-EGFPnls

Figura 1. Esferoides tumorais de cocultura preparados^*1

Preparação de amostras

As amostras foram tratadas com estaurosporina (STS) por 5 horas em concentrações de 3,7 nM a 3,75 μM para atingir uma proporção de 1:1 de células A549 e células HeLa nos esferoides. Usando a diferença na permeabilidade da membrana, determinamos a viabilidade celular pela coloração de todos os núcleos com 10 μM de Hoechst 33342 (DOJINDO) e dos núcleos das células mortas com 1 μM de TO-PRO3 (Thermo Fisher Scientific®). Em seguida, lavamos as amostras três vezes com 1x PBS e as fixamos com paraformaldeído a 4% de um dia para o outro a 4 °C (39,2 °F). Antes da formação de imagem, os esferoides foram tratados com o reagente de limpeza de tecidos SCALEVIEW-S4 (FUJIFILM Wako), de um dia para o outro, em temperatura ambiente.

Imagem e análise

Foram obtidas imagens fluorescentes de esferoides usando o microscópio confocal de varredura a laser FLUOVIEW® FV3000 com uma objetiva superapocromática A Line (UPLSAPO30XS). O colar de correção da objetiva foi ajustado para corresponder ao índice de refração do líquido de imersão para fornecer imagens de alta qualidade e morfologia 3D. Várias das imagens foram importadas para o software de análise celular NoviSight™ 3D, onde foram reconstruídas tridimensionalmente. O software NoviSight pode reconhecer objetos, como núcleos, e realizar várias análises dos sinais contidos nos objetos.

Resultados

Formação de imagem da sensibilidade a medicamentos em esferoides de cocultura

Tornar os esferoides transparentes e fazer imagens deles com um microscópio confocal de varredura a laser FV3000 nos permitiu obter imagens dos esferoides tumorais cocultivados em profundidade. O tratamento com estaurosporina aumentou o número de células mortas de uma maneira dependente da dose (Fig.  2^*1). A análise tridimensional é necessária para determinar quais células estão mortas e quantas células mortas existem em uma massa tridimensional.

Figura 2. Resposta a medicamentos em esferoides de cocultura^*1

Análise da sensibilidade a medicamentos em esferoides de cocultura

Os sinais Hoechst 33342 nos permitiram reconhecer os núcleos. Todas as células foram classificadas em dois grupos com base na presença ou ausência de um sinal de EGFP: EGFP positiva (células HeLa) e EGFP negativa (células A549). As células nesses dois grupos foram posteriormente divididas de acordo com a presença ou ausência de sinais de células mortas (TO-PRO3, vermelho) para um total de quatro grupos (Fig.  3^*1). A porcentagem de células vivas em relação ao total tanto de células A549 como de células HeLa foi calculada e representada graficamente (Fig.  4). Os resultados mostraram que as células HeLa eram mais sensíveis à estaurosporina do que as células A549.

Usando o software NoviSight™, foi possível classificar os tipos de células contidos em cada esferoide tumoral de cocultura e analisar a capacidade de resposta específica do tipo de célula ao medicamento.

Figura 3. O software NoviSight pode classificar as células em 4 grupos com base nos sinais^*1
*2 As duas galerias à direita não exibem os sinais Hoechst
 

Concentração de estaurosporina

Figura 4. Diferença na capacidade de resposta ao medicamento entre as células A549 e as células HeLa

Estratégia de análise espacial

As imagens são capturadas tridimensionalmente para que uma análise espacial mais complicada possa ser realizada. Isso permite a análise do comportamento celular em tecidos heterólogos, como o câncer. O software NoviSight™ pode definir a região a ser analisada. Configuramos o software para analisar o centro e a periferia de cada esferoide e criamos oito grupos (Fig.  5). Em seguida, realizamos uma análise populacional dentro dessas áreas (Fig.  6). Este método permite a análise espacial da eficácia de medicamentos em esferoides tumorais de cocultura.

Figura 5. Diagrama esquemático de análise espacial
 

Figura 6. O software NoviSight pode classificar as partes centrais e periféricas

Análise espacial da eficácia do medicamento

O software NoviSight™ pode não apenas contar o número de células mortas, mas também analisar a eficácia espacial do medicamento. Para demonstrar essa funcionalidade, realizamos uma análise espacial de cada célula morta nos esferoides de cocultura. Foi calculada a proporção entre cada célula morta e o número de células nas áreas central e periférica (Fig.  7). Nesse caso, não houve diferença na eficácia do medicamento entre essas duas regiões. O número de células mortas no centro e na periferia aumentou de maneira dependente da dose.

Concentração de estaurosporina

Figura 7. Diferença na capacidade de resposta ao medicamento entre as regiões central e periférica

Conclusão

Usando o software NoviSight e o microscópio confocal de varredura a laser FLUOVIEW® FV3000, foi possível classificar os tipos de células contidas em esferoides tumorais de cocultura e analisar a capacidade de resposta específica do tipo de célula ao medicamento. Ao alterar a combinação de coculturas, o microambiente de vários cânceres pode ser reproduzido com sucesso e a eficácia dos medicamentos anticâncer pode ser avaliada.

Autores

Hiroya Ishihara, Tecnologia de Avaliação Biológica 2, Pesquisa e Desenvolvimento

*1 Embora tenha se tornado uma das linhagens celulares mais importantes na pesquisa médica, é importante reconhecer que a contribuição de Henrietta Lacks para a ciência aconteceu sem o seu consentimento. Essa injustiça, embora tenha levado a descobertas importantes em imunologia, doenças infecciosas e câncer, também levantou discussões importantes sobre privacidade, ética e consentimento na medicina.
Para saber mais sobre a vida de Henrietta Lacks e sua contribuição para a medicina moderna, clique aqui.
http://henriettalacksfoundation.org/