A importância da limpeza de tecido e da seleção objetiva na análise 3D de esferoides

Resumo

Modelos tridimensionais (3D) como esferoides ou organoides são espessos e opacos devido à dispersão da luz, por isso é difícil obter imagens profundas deles e manter toda a morfologia. No entanto, as técnicas de limpeza de tecido tornam possível obter imagens no interior dessas amostras, controlando os diferentes índices de refração (RIs) entre os compartimentos celulares.

Nesta nota de aplicação, apresentamos um protocolo de limpeza de esferoide de uma etapa usando o reagente de limpeza de tecido SCALEVIEW-S4, bem como descrevemos a importância da correspondência do RI entre os esferoides limpos e as lentes objetivas.

Introdução

Modelos 3D, como esferoides e organoides, são populares porque emulam o microambiente in vivo com mais precisão do que os modelos clássicos de monocamada 2D. No entanto, é difícil obter imagens de seções profundas de modelos 3D espessos devido à dispersão de luz causada por compartimentos celulares, como os lipídios ou as pigmentações.

Atualmente, muitas técnicas ópticas de limpeza de tecido (1, 2) podem tornar os esferoides ou organóides transparentes. Essas técnicas de limpeza são normalmente divididas em três tipos: técnicas à base de solvente, à base de água e de incorporação de hidrogel. SCALEVIEW-S, um reagente de limpeza aquoso, raramente causa alterações morfológicas nas amostras limpas (3).

Nesta nota de aplicação, seguimos o método de limpeza de esferoides SCALEVIEW-S4. Como as amostras 3D transparentes tendem a ter um alto índice de refração, também descrevemos o efeito da não-correspondência de RI comparando imagens adquiridas usando objetivas secas (RI: 1,0), de água (RI: 1,33) e de silicone (RI: 1,4).

Materiais e métodos

Preparação de amostra

Células de adenocarcinoma colorretal humano (linha HT-29) foram semeadas em uma microplaca de fundo em U de 384 poços e cultivadas até que o diâmetro do esferoide fosse de cerca de 300 μm. Os esferoides foram fixados com solução de paraformaldeído (PFA) a 4% a 4 °C (39,2 °F) durante a noite e tingidos com solução DAPI em PBS (-).

Método de limpeza

SCALEVIEW-S0, S1, S2, S3, S4, e a solução descalcificante foram adquiridos (FUJIFILM Wako Chemicals) ou fabricados (3). A Tabela 1 mostra o protocolo original usando esses reagentes.

Tabela 1. Protocolo SCALEVIEW-S original

Método para obter imagens

Nós obtivemos imagens dos esferoides HT-29 tingidos com DAPI com e sem limpeza usando nosso microscópio confocal de varredura a laser FLUOVIEW FV3000 e as três diferentes objetivas de imersão descritas acima.

Resultados e discussão

Limpeza de esferoide de uma etapa usando SCALEVIEW-S4

O protocolo SCALEVIEW-S original envolve trocas sequenciais de líquido de seis reagentes diferentes (S0 – S4, descalcificação). A amostra se expande e se contrai durante o tratamento com os reagentes S0 – S3 e a solução de descalcificação, permitindo que S4 limpe o tecido e retorne o volume a quase 100% do seu tamanho original.

O protocolo original é otimizado para limpar cérebros de camundongos inteiros, então leva cerca de 12 horas para cada reagente limpar a amostra. Como os esferoides ou organóides espessos de aproximadamente 200–300 μm são muito menores que o cérebro de um camundongo, eles podem ser limpos com incubação no reagente S4 por cerca de uma hora com rotação suave após serem fixados e tingidos.

Tanto o esferoide limpo com S4 como o esferoide limpo usando o protocolo original mantiveram sua morfologia, como mostrado na Fig. 1a abaixo. Você pode ver a intensidade fluorescente de cada esferoide limpo para cada posição Z na Fig. 1b. Os resultados mostram quantitativamente que o esferoide pode ser limpo usando o tratamento único do reagente S4. Isso significa que pequenos modelos 3D como esferoides ou organoides podem ser facilmente limpos com um protocolo de uma etapa usando S4 após serem fixados e tingidos, ajudando a simplificar a formação de imagens do modelo 3D.

Fig. 1. Esferoides HT-29 limpos usando os protocolos SCALEVIEW-S e SCALEVIEW-S4. Ambos os protocolos podem limpar o esferoide.

A importância da correspondência de RI entre objetivas e amostras 3D

Para obter imagens precisas de amostras 3D limpas usando microscopia confocal ou multifotônica, você deve considerar a correspondência de RI entre as objetivas e as amostras 3D. Caso contrário, a não correspondência de RI afeta a qualidade da imagem na profundidade da amostra 3D. Neste caso, uma grande diferença no RI entre as objetivas e as amostras 3D causou a distorção do objeto na direção Z devido à aberração.

A Figura 2 abaixo compara a resolução da imagem dos esferoides HT-29 limpos com S4 (RI: 1,47) capturados com as três objetivas: de imersão seca (RI: 1,00, UCPLFLN20X), de água (RI: 1,33, UAPON20XW340) e de silicone (RI: 1,40, UPLSAPO30XSIR)

Fig. 2. O efeito da seleção da objetiva de imersão na resolução da imagem. Esquerda: seca (RI: 1,00, UCPLFLN20X). Meio: água (RI: 1,33, UAPON20XW340).
Direita: silicone (RI: 1,40, UPLSAPO30XSIR)).

Conforme mostrado na Fig. 2, selecionar a lente objetiva ideal para correspondência de RI nos ajuda a adquirir imagens limpas para compreender com mais precisão a morfologia das amostras 3D.

Os efeitos da limpeza dos esferoides para análise quantitativa 3D

Podemos analisar quantitativamente as amostras 3D, limpando-as e adquirindo várias imagens de plano Z usando uma objetiva apropriada. Usamos o software de análise de células NoviSight™ 3D para realizar a contagem de células 3D nos esferoides HT-29 tingidos com DAPI com e sem limpeza. Também comparamos a precisão da contagem de células entre as imagens 3D adquiridas usando diferentes objetivas de imersão (Fig. 2). Verificamos o número de células esferoides por tripsinização e contagem manual do número de células.

A análise da contagem de células do software NoviSight detectou menos de 20% do total de células (versus esferoides com tripsina) em um esferoide não limpo. Em contraste, o software detectou mais de 90% do total de células em um esferoide limpo (Fig. 3).

A imagem da objetiva seca provavelmente tinha um número de células menor do que os esferoides tratados com tripsina devido ao reconhecimento incorreto de uma proporção sinal-ruído ruim (ver o retângulo vermelho na Fig. 3). E enquanto o software detectava quase completamente o núcleo na imagem da objetiva de água, ele perdeu o núcleo no fundo do esferoide (retângulo amarelo na Fig. 3).
No entanto, o software reconheceu completamente o núcleo na imagem da objetiva de silicone (retângulo verde na Fig. 3).

Fig. 3. Efeitos da limpeza de esferoides e da seleção da objetiva na contagem de células 3D.

Conclusão

As técnicas de limpeza nos permitiram contar células profundamente dentro da amostra para que pudéssemos realizar uma análise quantitativa 3D.

Referências

1. Peng Wan et al., Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain, Neurophotonics (2018)
2. Douglas S. Richardson et a., Clarifying Tissue Clearing, Cell (2015)
3. Hama et al., ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging, Nat Neurosci. (2015)

Autor

Mayu Ogawa (Olympus)