Observação de estruturas neurais entre o córtex e o tálamo em cérebro de sagui usando o FLUOVIEW FV3000

O córtex pré-frontal (CPF) é desproporcionalmente maior em humanos e é responsável por funções cognitivas e executivas avançadas. Sua disfunção pode causar distúrbios psiquiátricos, como a esquizofrenia e o mal de Alzheimer. O CPF de ratos tem sido ativamente estudado, mas não apresenta uma região correspondente ao córtex frontal granular, indicando uma grande diferença estrutural em relação ao CPF dos primatas. A pesquisa em modelos de primatas é, portanto, importante para associar os estudos em ratos e humanos. Nosso grupo de pesquisa está usando saguis, um pequeno macaco nativo da América do Sul, como primata modelo.

Neste experimento, investigamos as interações entre o CPF e o núcleo reticular do tálamo (NRT), que é um grupo de neurônios inibitórios ao redor do tálamo. O NRT age como um portão que controla a transmissão de informações do córtex cerebral para o tálamo. Investigamos a morfologia detalhada das fibras axonais no NRT, que viajam do CPF ao tálamo.

Figura 1. Diagrama mostrando como os axônios neurais entram no tálamo a partir do córtex pré-frontal através do núcleo reticular do tálamo. O núcleo reticular do tálamo age como um portão para o tálamo.

Formação de imagem de macro a micro usando um fluxo de trabalho simples

As fibras axonais originárias do CPF passam por um corredor chamado de cápsula interna como um feixe grosso. Esse feixe de axônios entra no tálamo através da parte anterior do NRT, onde apresenta morfologias complexas ao se dividir e reorientar. Para identificar o NRT de forma precisa, usamos PV (parvalbumina) como marcador (Fig. 1).

A função de macro a micro do microscópio confocal de escaneamento a laser FLUOVIEW FV3000 conecta facilmente as visualizações macro e micro para a formação de imagem confocal. Usamos essa função para obter uma imagem geral de baixa ampliação das fibras axonais do CPF que passam pelas células positivas para PV e, em seguida, alternamos para uma ampliação alta para observar as ramificações das fibras axonais finas e terminações nervosas tipo botão.

Para a observação de alta ampliação, uma objetiva de imersão em óleo de silicone foi usada para observar a parte mais profunda da amostra detalhadamente em alta resolução. Com a baixa ampliação, somente conseguimos observar as fibras axonais grossas que passam pelo NRT. Com uma objetiva de imersão em óleo de silicone de 40X, conseguimos observar as fibras que passam serem ramificadas de forma fina e decoradas com inúmeras estruturas granulares tipo botão (Fig. 2).

Figura 2. Uso da função de macro a micro para mapear onde as fibras axonais encontram o NRT no caminho para o tálamo a partir do CPF do cérebro de sagui. Uma vez que os neurônios do NRT são compostos por neurônios inibidores positivos para PV, eles podem ser identificados pelos anticorpos de PV (vermelho). A cor verde indica os terminais axônicos do córtex cerebral e a cor ciano indica os núcleos.

Condições da formação de imagem
Microscópio: microscópio confocal de escaneamento a laser FLUOVIEW™ FV3000
Laser: 405 nm (DAPI, ciano), 488 nm (GFP, verde), 561 nm (parvalbumina, vermelho)

a. Objetiva: PLAPON1.25X, união de imagens: 3 × 3, escala gráfica: 3000 μm
b. Objetiva: UPLXAPO10X, união de imagens: 2 × 2, escala gráfica: 300 μm
c. Objetiva: UPLSAPO40XS, união de imagens: 2 × 2, escala gráfica de 73 cortes: 30 μm (somente verde e vermelho são exibidos)

Observação tridimensional de alta resolução da estrutura fina das fibras axonais

Uma imagem em pilha Z foi obtida usando uma objetiva de imersão em óleo de silicone de 100X para a reconstrução tridimensional (Fig. 3). Conseguimos observar as estruturas tridimensionais detalhadas dos grânulos tipo botão ao redor dos neurônios do NRT.

Comentários do Dr. Watakabe

Neste experimento, foi necessário alternar entre uma objetiva de baixa ampliação e uma de alta ampliação. A função de mapeamento de macro a micro do microscópio FV3000 permitiu realizar esta transição facilmente e nos permitiu navegar pela imagem geral do cérebro, capturando ao mesmo tempo a estrutura fina em uma alta ampliação. O uso da objetiva de imersão em óleo de silicone nos ajudou a observar a morfologia fina das terminações nervosas tipo botão.

Contexto da pesquisa

Esta pesquisa foi realizada como parte do projeto "Mapeamento cerebral usando neurotecnologias integradas para estudos de doenças" (Brain/MINDS). Este projeto tem como objetivo aprofundar a nossa compreensão de distúrbios psiquiátricos e neurológicos e, finalmente, superá-los examinando os circuitos neurais do modelo de primata. O Dr. Watakabe faz parte de um grupo de pesquisa encarregado de criar mapas de estruturas cerebrais de saguis, com foco nas conexões do córtex pré-frontal (CPF) em particular.

Artigos relacionados:
Okano, H., Sasaki, E., Yamamori, T., Iriki, A., Shimogori, T., Yamaguchi, Y., Kasai, K., Miyawaki, A. “Brain/MINDS:.” Neuron., 2016, Nov. 2;92(3):582-590. doi:10.1016/j.neuron.2016.10.018.

Como o microscópio confocal de escaneamento a laser FV3000 possibilitou o nosso experimento

Objetivas de imersão em óleo de silicone: possibilitando imagens claras em amostras de tecido grosso

A gama de objetivas de imersão em óleo de silicone de alto desempenho da Olympus oferece uma observação de tecido profundo de alta resolução de amostras transparentes. Uma vez que o índice de refração do óleo de silicone (cerca de ne 1,40) é próximo ao índice de refração do tecido vivo (cerca de ne 1,38), essas objetivas ajudam a evitar a aberração esférica causada pela variação do índice de refração, permitindo a aquisição 3D de estruturas teciduais com alta definição.