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Notas de aplicação

Observação de um esferóide tumoral vascularizado em um chip com um microscópio confocal


Estudos mostram que os tumores induzem o crescimento dos vasos sanguíneos para apoiar a atividade tumoral vigorosa. Esses vasos sanguíneos servem como linhas de vida do tumor e desempenham um papel importante no microambiente tumoral (TME) para apoiar essa atividade. Até agora, as respostas do tumor a estímulos bioquímicos e biomecânicos foram avaliadas em condições estáticas e não conseguiram incorporar os efeitos do fluxo sanguíneo aos tumores. Neste estudo, apresentamos uma plataforma tumor-on-a-chip que permite a avaliação de um microambiente tumoral com fluxo de mídia através de uma rede vascular perfusável e medir os efeitos da administração de medicamentos incorporados ao fluxo sanguíneo.

Observação 3D do esferóide tumoral no dispositivo microfluídico

Figura 1. Dispositivo microfluídico e modelo de tumor.

Figura 1. Dispositivo microfluídico e modelo de tumor.
(Esquerda) Imagem do dispositivo microfluídico, (direita) modelo de tumor com uma rede vascular perfusável.

Neste estudo, recapitulamos o microambiente tumoral, incluindo a rede vascular, pela cocultura de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) com esferóides contendo células de adenocarcinoma de mama humano (MCF-7) em dispositivos microfluídicos. Para confirmar a perfusabilidade de uma rede vascular no dispositivo microfluídico, observamos se esferas fluorescentes (verdes) passaram continuamente pela rede vascular e esferóide usando o microscópio confocal FV3000RS. As amostras de cultura 3D são difíceis de visualizar devido à espessura da massa. Normalmente, é necessária uma intensidade de luz de excitação mais alta para produzir um sinal fluorescente suficientemente forte para detecção. Contudo, uma luz de excitação mais alta também aumenta a fototoxicidade, resultando em danos nas células. Para superar isso, usamos o microscópio confocal FV3000, que incorpora a tecnologia de detecção TruSpectral da Olympus e detectores GaAsP de alta sensibilidade, para capturar sinais fluorescentes fracos e minimizar a potência do laser.

(a)

(a) Imagem de projeção do esferóide tumoral. Barra de escala: 200 μm, objetiva: UPLSAPO10X2.

(b)

(b) imagem em 3 planos (xy, xz, yz) da moldura branca em (a). Barra de escala: 20 μm, objetiva: UPLSAPO40X2.

Figura 2. O esferóide tumoral e sua rede vascular.
Nuclear: ciano (405 nm, Hoechst 33342), RFP-HUVEC: magenta (561 nm, RFP), E-caderina: amarelo (640 nm, Alexa Fluor 633).
(a) Imagem de projeção do esferóide tumoral. Barra de escala: 200 μm, objetiva: UPLSAPO10X2.
(b) imagem em 3 planos (xy, xz, yz) da moldura branca em (a). Barra de escala: 20 μm, objetiva: UPLSAPO40X2.

Imagem rápida do fluxo sanguíneo usando o escâner ressonante

Também examinamos o fluxo na rede vascular do esferóide tumoral usando microesferas fluorescentes (verde, diâmetro: 3,1 μm). Ao observar o fluxo sanguíneo rápido, a velocidade de varredura do escâner galvanômetro normal pode não ser suficiente. Neste experimento, as imagens foram capturadas usando o microscópio confocal Olympus FV3000RS equipado com um escâner ressonante de alta velocidade. Confirmamos que, quando microesferas fluorescentes foram injetadas no canal 3 do dispositivo microfluídico, as microesferas passaram pelas estruturas luminais do esferóide e alcançaram o canal 1, indicando a perfusabilidade da rede vascular projetada. Ao confirmar a validade deste modelo de esferóide de tumor projetado para estudar os efeitos do fluxo sanguíneo no TME, foi esclarecido em experimentos subsequentes que a eficácia dos medicamentos no TME, incluindo a rede de vasos sanguíneos, varia dependendo da presença ou ausência de fluxo intravascular. Esperamos que nosso modelo tridimensional possa contribuir para o desenvolvimento de medicamentos como um modelo de administração de medicamentos transvascular no futuro.

Vídeo: fluxo de contas fluorescentes dentro de vasos sanguíneos e esferóides tumorais construídos em um dispositivo microfluídico
Condição de imagem: 65 msec/quadro. Barra de escalas: 100 μm

Comentário da Dra. Yokokawa

A novidade deste estudo foi uma rede vascular perfusável construída em um esferóide tumoral. Era importante visualizar como a rede vascular conectava os canais esferóide e microfluídico. Além disso, era essencial observar simultaneamente a luz vascular e o fluxo através da vasculatura para demonstrar a perfusabilidade. O escâner ressonante de alta velocidade instalado no microscópio confocal FV3000 possibilitou a geração de imagens da rede vascular (etiquetada com RFP) e o fluxo dinâmico de microesferas (verde).

Dr. Ryuji Yokokawa

Dr. Ryuji Yokokawa1

Dr. Yuji Nashimoto

Dr. Yuji Nashimoto2

Agradecimentos
Esta nota de aplicação foi preparada com a ajuda dos seguintes pesquisadores:
Departamento de Microengenharia, Universidade de Quioto1
Frontier Research Institute for Interdisciplinary Sciences (FRIS), Tohoku University2

Referências
Nashimoto Y, Okada R, Hanada S, Arima Y, Nishiyama K, Miura T, Yokokawa R. Biomateriais. 2020, janeiro; 229: 119547. “Vascularized cancer on a chip: The effect of perfusion on growth and drug delivery of tumor spheroid”. doi: 10.1016 / j.biomaterials.2019.119547

Como o microscópio confocal FV3000 facilitou nosso experimento

O sistema totalmente espectral com detectores GaAsP de alta eficiência proporciona alta sensibilidade para aquisição de imagens de células vivas

Como o microscópio confocal FV3000 facilitou nosso experimento

A série do microscópio FV3000 usa a tecnologia de detecção TruSpectral da Olympus que difrata a luz por transmissão, por meio de uma unidade de holograma de fase volumétrica. Essa tecnologia permite um rendimento de luz muito superior, quando comparada a unidades de detecção espectral convencionais com grades de tipo refletivo. O detector espectral de alta sensibilidade (HSD) de dois canais do microscópio FV3000 usa tecnologia TruSpectral com PMTs GaAsP e resfriamento Peltier para obter uma alta eficiência quântica de 45% com uma alta relação sinal-ruído. Essa combinação de tecnologias de detecção permite uma detecção potente de alta sensibilidade e minimiza a potência do laser necessária para observação de tecido vivo.

Duas opções de unidades de varredura

Plaquetas ligadas a uma trombose nos vasos sanguíneos de um rato. Imagens feitas com 30 fps em fotograma completo com o escâner ressonante com 2 CH GaAsP PMTs.

Imagem: cortesia do: Dr. Takuya Hiratsuka, Dr. Michiyuki Matsuda, Escola de Pós-graduação de Estudos Biológicos, Universidade de Quioto.

Escolha entre duas unidades de escâner: um escâner galvanômetro tradicional (FV3000) ou um escâner híbrido galvanômetro/ressonante (FV3000RS). O escâner ressonante possibilita capturar 30 quadros por segundo com campo de visão completo a 512 × 512 píxeis ou até 438 quadros por segundo recortando o eixo Y para capturar eventos fisiológicos vivos essenciais, como fluxo de íons de cálcio

Produtos usados nesta aplicação

Microscópio de escaneamento a laser confocal

FV3000

  • Disponível para configurações de escâner híbrido galvanômetro/ressonante (FV3000RS) ou apenas galvanômetro (FV3000)
  • Detecção TruSpectral extremamente precisa e eficiente em todos os canais
  • Otimizado para imagem de célula viva com alta sensibilidade e baixa fototoxicidade
  • Inverted and upright frame options to suit a variety of applications and sample types

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