Métodos de detecção em microscopia confocal

A microscopia confocal é uma técnica clássica para examinar a expressão de proteínas e as interações em amostras de tecido espesso. Em contraste com a microscopia de epifluorescência de campo amplo, que captura fótons emitidos de todo o campo de visão (incluindo fótons fora do plano focal), a microscopia confocal usa um orifício que é conjugado ao plano focal para rejeitar a luz fora de foco e criar um sistema de imagem óptica seccionada apenas do plano do tecido em foco.

O método confocal é eficaz na obtenção de imagens nítidas e de alta resolução de amostras espessas, mas a perda inerente de luz do orifício torna difícil capturar imagens com uma alta relação sinal-ruído. Por causa disso, é fundamental garantir que o resto do caminho óptico do microscópio seja altamente eficiente para minimizar a exposição ao laser necessária para gerar uma imagem e detectar o máximo possível de fótons emitidos.

Diferenças entre as técnicas de filtro e detecção de luz espectral

Na detecção baseada em filtro, você coloca um filtro bandpass na frente do tubo fotomultiplicador (PMT) para selecionar quais comprimentos de onda de luz vão para o detector. Na detecção baseada em espectro, uma grade ou um prisma é usado para criar um espectro da luz emitida, permitindo que você ajuste com precisão qual banda ou bandas do espectro de emissão você deseja detectar.

A detecção baseada em espectro também permite que você execute “varreduras lambda”, nas quais todo o espectro de luz emitida pode ser perfilado em larguras de banda e tamanhos de passo específicos.

Embora os métodos de detecção baseados em espectrais permitam experimentos mais flexíveis, tradicionalmente há uma compensação em termos de sensibilidade. A detecção baseada em espectro fornece maior flexibilidade, mas a detecção baseada em filtro é normalmente mais eficiente.

Origens da espectroscopia na microscopia

Para criar um espectro, a tecnologia de detecção espectral se baseou em dois métodos — grades de difração do tipo reflexão e sistemas baseados em prisma. A tecnologia de reflexão estreou no primeiro microscópio confocal disponível comercialmente no final da década de 1990 (Figura 1). Pouco depois, um sistema confocal baseado em prisma tornou-se disponível.

Como mencionado acima, os métodos de detecção espectral tendem a ser menos eficientes do que os métodos baseados em filtro. Existem três fatores que contribuem para essa diferença de eficiência:

• Perda de difração de ordem superior: Quando a luz é refletida em uma rede de difração, várias ordens de difração são criadas. Uma vez que apenas a primeira ordem de difração progride através do caminho de detecção, as ordens superiores de difração são perdidas.
• Perda de polarização dependente: A refletância da luz difere dependendo do estado de polarização, com a eficiência de difração da luz P-polarizada sendo menor do que a da luz S-polarizada para grades de reflexão.
• Eficiência dependente do comprimento de onda da grade de reflexão: A eficiência da difração atinge um máximo em um determinado comprimento de onda, e a eficiência em comprimentos de onda maiores ou menores será pior.

Redes de difração do tipo reflexão sofrem com todos esses três fatores e são o método menos eficiente de detecção espectral. Os métodos de detecção baseados em prisma superam o problema de perda de luz de difração de ordem superior, mas a resolução espectral sofre em comprimentos de onda mais longos. Por causa dessas desvantagens, nenhuma das tecnologias foi capaz de substituir totalmente a necessidade de sistemas de detecção baseados em filtro.

Figura 1: Linha do tempo da microscopia confocal e tecnologias de detecção baseadas em espectrais

Holograma de fase de volume: uma abordagem diferente para grades

Por quase duas décadas, grades de difração do tipo reflexão e tecnologias baseadas em prisma impulsionaram a maioria das aplicações de espectrologia em microscópios confocais em todos os fabricantes. No entanto, a microscopia não é o único campo a confiar na espectroscopia como meio de formação de imagens — a astronomia também. A espectroscopia na astronomia é semelhante à microscopia no sentido de que objetos astronômicos de interesse (como galáxias e outros corpos celestes) também emitem luz do ultravioleta para o infravermelho, e os astrônomos precisam ser capazes de diferenciar esses componentes da luz para construir imagens precisas deles (Figura 2).

Figura 2: Aplicação da espectroscopia em astronomia para construir a imagem de uma galáxia.
Crédito: NASA, ESA, Dan Maoz (Universidade de Tel Aviv, Israel e Universidade de Columbia, EUA)

Uma das principais tecnologias que os astrônomos usam para fazer isso é o holograma de fase de volume (VPH). Em vez de refletir a luz em uma grade de relevo de superfície para produzir um espectro de luz, as grades VPH usam uma abordagem transmissiva, passando a luz por uma grade para difratar a luz incidente em seus componentes espectrais (Figura 3). Experimentos de astronomia usando grades VPH foram publicados pela primeira vez por volta dos anos 2000, e a tecnologia foi rapidamente adotada. Redes VPH em grande escala foram implementadas com sucesso para espectroscopia em alguns dos maiores laboratórios do mundo.

Figura 3: Diagramas de seção transversal dos mecanismos de difração por grades de relevo de superfície e grades holográficas de fase de volume. As grades de relevo de superfície (à esquerda) refletem a luz da superfície da grade, enquanto as grades VPH (à direita) transmitem luz através da grade.

Em 2016, a tecnologia VPH foi implementada em um microscópio comercial pela primeira vez com o lançamento do microscópio confocal FLUOVIEW™ FV3000 com tecnologia de detecção TruSpectral™, que usa um VPH para permitir difração de luz do tipo de transmissão. Os benefícios do uso de grades VPH em microscopia incluem:

• Sensibilidade de baixa polarização
• Baixa dispersão (alta eficiência)
• Alta transmissão em todo o espectro (especialmente em vermelho em comparação com grades de difração do tipo reflexão)
• Mais flexível do que filtros

Por usar uma rede de difração de transmissão, a tecnologia TruSpectral supera muitos dos desafios normalmente associados aos métodos convencionais de detecção espectral. Por exemplo, sua perda dependente de polarização é mínima em comparação com a perda significativa que normalmente ocorre com redes de difração do tipo reflexão. Além disso, o VPH remove a dependência do comprimento de onda da eficiência de difração. As grades do tipo reflexão têm um ângulo fixo, de modo que só podem ser otimizadas para um comprimento de onda, enquanto o ângulo do VPH pode ser controlado para otimizar a eficiência em qualquer comprimento de onda de detecção. Isso permite maior eficiência de transmissão em todo o espectro, especialmente em comprimentos de onda mais longos.

Como funcionam as grades VPH no microscópio FV3000

Nosso uso do VPH em nossa tecnologia de detecção TruSpectral no microscópio confocal FV3000 depende de três características principais (Figura 4):

• Um ajuste de ângulo motorizado do VPH para otimizar automaticamente seu ângulo para os comprimentos de onda da luz que estão sendo detectados
• Um espelho lambda motorizado ajustável, que é usado para direcionar regiões específicas do espectro produzido pelo VPH para o PMT
• Uma fenda ajustável motorizada bem na frente do PMT, que pode ser ajustada livremente de 1 nm a 100 nm, com tamanhos de passo entre 1 nm

Juntos, esses recursos permitem a detecção espectral linear de alta resolução de 400 nm a 800 nm.

Figura 4: Diagrama do sistema de detecção TruSpectral baseado em VPH no microscópio confocal FV3000

Benefícios da detecção TruSpectral para imagens de fluorescência usando corantes vermelhos

O VPH fornece não apenas maior flexibilidade, mas também fornece melhora significativa na eficiência de transmissão do sistema de detecção, particularmente na janela desejável do vermelho para o vermelho distante (Figura 5).

Os corantes com deslocamento para o vermelho estão se tornando mais populares para aplicações de imagem, uma vez que a luz com deslocamento para o vermelho é menos fototóxica, permite melhor penetração nos tecidos e expande as capacidades de multiplexação. No entanto, os fluoróforos vermelhos são frequentemente difíceis de obter imagens usando tecnologias de imagem baseadas em espectrais tradicionais devido à baixa eficiência de transmissão e resolução espectral de grades de difração do tipo reflexão e prismas. A detecção espectral baseada em VPH não só permite uma transmissão mais alta de luz vermelha, mas também mantém a precisão e a resolução do espectro resultante, permitindo uma resolução espectral precisa de 1 nm até 800 nm.

Figura 5: Comparação da eficiência de transmissão da tecnologia de detecção TruSpectral baseada em VPH no microscópio FV3000 versus grades de difração baseadas em reflexão usadas no microscópio FV1200. O uso de grades VPH resulta em uma transmissão até 3 vezes maior em comparação aos métodos tradicionais de detecção espectral.

As melhorias habilitadas pela grade VPH nos permitiram projetar e construir o microscópio FV3000 como um sistema totalmente baseado em espectrais, o que significa que cada detector usa a tecnologia de detecção TruSpectral baseada em VPH, conforme mostrado na Figura 4. Um sistema totalmente espectral com canais independentes permite que você remova vários sinais de intensidade variável para detecção simultânea de fluorescência brilhante e fraca (Figura 6).

Figura 6: A “varredura lambda” espectral de células COS-7 produz uma separação clara de sinais altamente sobrepostos

Da astronomia à microscopia, as grades VPH estão provando ser uma ferramenta poderosa para realizar experimentos de espectroscopia. Fique ligado para ver onde a viagem nos levará a seguir.

Figura 7: Comparação de aplicações de espectroscopia em astronomia versus microscopia. Em cima: separação espectral da luz emitida por diferentes corpos celestes dentro de uma galáxia. Embaixo: separação espectral de quatro estruturas diferentes dentro de uma célula. Crédito das principais imagens: NASA, ESA, Dan Maoz (Universidade de Tel Aviv, Israel e Universidade de Columbia, EUA)

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