Desde a primeira observação de células particionadas em formato de cubo sob lentes caseiras, feita por Robert Hooke, passando pela pesquisa de Osamu Shimomura sobre aequorina e proteína verde fluorescente (Green fluorescent protein, GFP) de águas-vivas, até as inéditas moléculas corantes com brilho intermitente de Xiaowei Zhuang usadas durante reconstruções tridimensionais em super resolução, jamais paramos de explorar o microcosmo da vida usando a microscopia óptica.
Como uma base da quarta revolução industrial, a engenharia de nanotecnologia ganhou destaque no século XXI, inicialmente em aplicações na área de ciências dos materiais. A colisão da nanotecnologia com as ciências da vida produziu as nanossondas fluorescentes, uma nova fagulha que iluminou o microcosmo da vida com a luz dos nanomateriais.
A alvorada da microscopia de fluorescência
A fluorescência é um tipo de fotoluminescência causado pela absorção de luz. A natureza tem diversos fenômenos fluorescentes. A proteína verde fluorescente (Green fluorescent protein, GFP) extraída de águas-vivas fluorescentes foi a primeira aplicação prática desse fenômeno para explorar o mundo microscópico com vida. No início da década de 90, pesquisadores revelaram que a introdução do gene da GFP em outros organismos vivos, visando sua expressão, poderia fazer com que organismos sem fluorescência natural passassem a produzir fluorescência verde. Desde então, os cientistas vêm aprimorando as cores disponíveis, intensidade de luz, estabilidade e outras propriedades da GFP mediante a análise de sua estrutura e mecanismos, gerando grandes avanços no desenvolvimento e aplicação de proteínas fluorescentes (Fluorescent proteins, FPs) nas imagens biológicas (Figura 1).
Figura 1. Imagens de fluorescência multicores do intestino posterior de larva de drosófila, com amarelo marcando actina F, verde marcando o núcleo e as marcas da tabela de consulta de intensidade (Intensitometric lookup table, LUT) indicando gotas de lipídeos
Embora a família de proteínas fluorescentes esteja ganhando corpo, seu escopo de aplicação ainda é limitado. O espectro de emissão das FPs é amplo e assimétrico, resultando em diafonia frequente na formação de imagem multicanal simultâneo. Com a ajuda de síntese química, vimos o surgimento dos corantes orgânicos com uma ampla variedade e operação simples. Isso não só expandiu o escopo de aplicação da formação de imagem fluorescente, como também facilitou a produção comercial padrão, que construiu alicerces sólidos para dar um salto no desenvolvimento.
Nanomateriais iluminam os avanços nas imagens biológicas
De maneira gradual, algumas desvantagens dos corantes orgânicos, como baixa eficiência de fluorescência e fotoestabilidade insatisfatória, fizeram o avanço das imagens de fluorescência tropeçar. Felizmente, graças a propriedades ópticas especiais inerentes, síntese e montagem direcionais, além de outras vantagens, os nanomateriais estão dando novo fôlego às imagens de fluorescência. No momento, os nanomateriais fluorescentes comuns incluem o seguinte (Figura 2):
- Pontos quânticos (Quantum dots, QDs) semicondutores
- Materiais de terras raras de conversão ascendente (nanopartículas de conversão ascendente [upconversion nanoparticles, UCNPs])
- Nanopartículas de metais nobres
Em comparação a outros corantes, os nanomateriais fluorescentes fornecem as vantagens de alta produtividade quântica, alta estabilidade, alto deslocamento de Stokes, amplo espectro de excitação e banda estreita do espectro de emissão. É possível alterar os comprimentos de onda de emissão desses nanomateriais fazendo um ajuste de tamanho. Também é possível aprimorar suas funções de biocompatibilidade, reconhecimento e sensoriamento por meio de montagem e modificações. Por fim, os nanomateriais oferecem um excelente potencial para marcação fluorescente, assim como para o futuro das imagens de fluorescência.
Figura 2. Exemplos ilustrados de nanopartículas orgânicas e inorgânicas, demonstrando os respectivos tamanhos, formas e materiais
Processo básico de trabalho para nanossondas fluorescentes
Por ser um processo interdisciplinar envolvendo as áreas de nanoquímica e imagens biológicas, o processo de trabalho para a engenharia de nanossondas fluorescentes é diferente do processo observado nas imagens biológicas tradicionais. Trata-se de um processo com várias etapas e que inclui computação teórica, síntese química, imagens biológicas e até testes médicos (Figura 3).
Figura 3. Processo básico de trabalho para nanossondas fluorescentes
A maioria dos processos de pesquisa que utilizam nanossondas fluorescentes é orientada a aplicações específicas. As imagens biológicas com nanossondas fluorescentes abrangem amostras in vitro a imagens dinâmicas in vivo e podem avançar para estudos e diagnósticos médicos. Portanto, a aplicação biológica é levada em consideração durante o projeto da nanossonda, enquanto a seleção de nanomateriais com propriedades ópticas especiais ou outras funções (p. ex., infravermelho próximo, conversão ascendente, dois fótons etc.) é feita de acordo com as necessidades específicas de aplicações biológicas. Em seguida, elas são sintetizadas e caracterizadas para a triagem de nanomateriais de alta qualidade. Posteriormente, as sondas passam por outras modificações e montagens (Figura 4) que levam em consideração a biocompatibilidade ou requisitos de função delas, p. ex., manipulação óptica, transporte de fármacos, reconhecimento molecular etc.
Figura 4. Renderização 3D de nanossondas de ouro (GNPs) funcionalizadas, revestidas com proteína verde fluorescente (GFP) e moléculas de ácido cítrico
Na pesquisa que envolve nanossondas fluorescentes, a microscopia óptica é aplicada principalmente em três áreas: caracterização, triagem de nanomateriais de alta qualidade e detecção de nanossondas in vivo. No processo de triagem, muitas vezes as características de diferentes partículas são altamente variáveis devido à heterogeneidade estrutural inerente a elas. Ao contrário dos métodos tradicionais que recorrem ao grupo
de características de um grande número de partículas reunidas, a microscopia óptica permite a triagem de sondas de alta qualidade com resolução de partícula individual, além da investigação adicional de suas relações entre estrutura e função visando orientar a síntese do design. Nas imagens biológicas, a microscopia óptica viabiliza a detecção de sinais ópticos de nanossondas in vivo para formar
imagens e rastrear suas reações espaçotemporais dinâmicas.
Aplicações de nanossondas fluorescentes e soluções de microscopia na área de pesquisa
Formação de imagem por infravermelho próximo/conversão ascendente usando uma solução de microscópio confocal
Graças à sua capacidade de alta penetração, baixa fototoxicidade e baixa interferência da autofluorescência do tecido, a formação de imagem por infravermelho próximo é atualmente uma das áreas de destaque na pesquisa com microscopia óptica. As nanossondas fluorescentes, como pontos quânticos, podem alcançar facilmente excitação com infravermelho próximo (Near-infrared, NIR) mediante ajustes na composição química, morfologia e tamanho. Além disso, a conversão ascendente de nanomateriais tem uma propriedade óptica especial que é útil na formação de imagem por NIR. Elas emitem uma luz de comprimento de onda mais baixo (luz visível ou ultravioleta) do que a luz de excitação quando estão sendo estimuladas por uma luz de comprimento de onda longo (NIR). Graças a essas vantagens, as nanossondas de conversão ascendente são tidas como uma nova geração de biomarcadores fluorescentes e devem assumir um papel importante na biomedicina, na pesquisa de energia e catálise e em outras áreas.
Hoje em dia, a detecção de hepatotoxicidade in vivo com sensibilidade e em tempo real enfrenta um gargalo no diagnóstico de lesão hepática induzida por medicamento. Em um artigo publicado em 2020, o grupo de pesquisa do Prof. Li Huijun relatou o desenvolvimento de uma nanossonda de conversão ascendente mediante a montagem de nanopartículas de conversão ascendente (UCNPs) e nanofilamentos de ouro (Gold nanorods, GNR) que foi aplicada ao diagnóstico em tempo real e in situ de lesão hepática induzida por medicamento. Essa nova nanossonda pode ser agregada no fígado e passar por ativação específica por um marcador de lesão hepática, miR122, produzindo imagens de fluorescência a 800 nm quando excitada por luz infravermelha próxima a 980 nm. Em combinação com transferência de energia por ressonância de luminescência (Luminescence resonance energy transfer, LRET) e tecnologia de amplificação de sinal, sua sensibilidade de detecção passa por um aumento posterior, atingindo a detecção altamente sensível de miR122 e proporcionando uma nova abordagem para o monitoramento clínico em tempo real de lesão hepática induzida por medicamento.[4]
Ao contrário da formação de imagem confocal convencional, a formação de imagem com nanossondas por NIR/conversão ascendente precisa de equipamentos com capacidades específicas:
- Os comprimentos de onda de excitação normalmente usados na microscopia confocal convencional variam de 400 a 650 nm, enquanto a formação de imagem por infravermelho próximo exige lasers NIR com comprimentos de onda > 700 nm
- A maioria dos componentes da trajetória ótica usados na formação de imagem convencional, como o galvanômetro de escaneamento, objetivas e grades de difração, só é compatível com antirreflexo/calibração no intervalo visível e não pode fornecer eficiência e precisão na formação de imagem por NIR
- A detecção de NIR requer detectores exclusivos de NIR > 750 nm
Para satisfazer esses requisitos, o microscópio confocal a laser FLUOVIEW™ FV4000 oferece uma solução de formação de imagem por NIR (Figura 5). O sistema FV4000 é especializado em formação de imagem por NIR altamente sensível, precisa e com mais cores.
FV4000 com formação de imagem por NIR
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Figura 5. O sistema modular de escaneamento a laser confocal FLUOVIEW FV4000 oferece uma solução de formação de imagem por NIR |
Nesta nota de aplicação preparada em colaboração com o Dr. Kai Li (Universidade Sulista de Ciências e Tecnologia, China), você pode ler sobre o bem-sucedido uso da solução de NIR FLUOVIEW para constatar a capacidade de direcionamento da molécula de fluorescência de NIR em nanopartículas com base em BTB em células tumorais. (Fig. 6) Os pesquisadores desse estudo modificaram a superfície da nanossonda BTB com o peptídeo direcionador Arg-Gly-Asp (RGD) e observaram que, no decorrer de 48 horas, o camundongo injetado com nanossondas BTB-RGD mostrou um aumento significativo no sinal de fluorescência por NIR-II no sítio tumoral em comparação à nanossonda BTB.
Figura 6. Imagens confocais de células 3T3, PC3 e U87 pelo FV3000 Vermelho após 4 horas de incubação com 40 μg mL-1 de nanossondas BTB-RGD ou BTB.
Comprimento de onda de excitação: 730 nm, filtro: 760–890 nm, escala gráfica = 50 μm.
Formação de imagem in vivo de marcadores tumorais usando a solução de detecção profunda em microscópio multifóton FLUOVIEW
O câncer é uma das mais preocupantes questões de saúde pública do mundo. Diagnóstico precoce e remoção precisa de tumores malignos estão no topo das prioridades da pesquisa médica atual. O design e o desenvolvimento de novas nanossondas fluorescentes para a identificação específica de marcadores tumorais e formação de imagem in vivo com alta resolução podem fornecer novas soluções de detecção para o diagnóstico clínico precoce de tumores malignos e a retirada cirúrgica precisa.
A superexpressão de enzimas como a fosfatase alcalina (FA) em células tumorais é um importante indicador clínico da ocorrência, desenvolvimento e progressão de tumores. Portanto, um método rápido de detecção que ofereça alta sensibilidade à atividade de FA pode ajudar na detecção precoce e na remoção de tumores com precisão. Em 2020, o Prof. Xiaojun Peng e sua equipe publicaram um artigo sobre o uso de uma nanossonda desenvolvida exatamente com essa finalidade. O artigo detalhou o projeto e a preparação de uma sonda AIEgen (DQM-ALP) que emite fluorescência forte mediante a agregação após interação com a superexpressão de FAs em células tumorais. Essa nanossonda projetada evitou o problema de inibição da fluorescência causado por agregação em corantes orgânicos convencionais, aumentando assim a sensibilidade de detecção e o tempo de retenção da sonda em células tumorais. Esse trabalho foi o primeiro a descobrir a regulação ascendente da atividade de FA em células tumorais por estimulação com butirato de sódio e cortisol, e usou microscopia de dois fótons para alcançar a alta resolução espacial da formação de imagem tridimensional em profundidade da atividade de FA em esferoides de tumor HeLa e HepG-2. O artigo demonstrou a utilidade da sonda na formação de imagem por detecção de fluorescência em tumores com tamanho inferior a milímetros, oferecendo uma poderosa ferramenta auxiliar para o diagnóstico clínico e a remoção cirúrgica de tumores.[5]
O estudo acima utilizou microscópios confocais de um e dois fótons. No entanto, o mais recente microscópio multifóton FLUOVIEW, desenvolvido para imagens de fluorescência profundas in vivo com um exclusivo galvanômetro de escaneamento ressonante de alta velocidade e uma trajetória altamente sensível de detecção óptica, é capaz de alcançar a formação de imagem 3D em profundidade e alta resolução de marcadores tumorais de uma maneira mais precisa e eficiente (Figura 7).
A combinação de detecção de alta sensibilidade e lasers de duas linhas/duplos em até seis canais no sistema multifóton da Evident é compatível com formação de imagem multicores mais flexível, aumentando ainda mais a produtividade operacional e a eficiência da detecção.
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Figura 7. O sistema multifóton FV4000MPE com módulos para formação de imagem em profundidade |
Detecção dinâmica de nanossondas em células vivas usando a solução rápida de super resolução IXplore™ SpinSR
Frequentemente reações bioquímicas e outros eventos moleculares em células vivas apresentam características espaçotemporais dinâmicas e significativas. A tecnologia de formação de imagem óptica é capaz de rastrear com precisão a movimentação de nanossondas e estudar suas interações com biomoléculas. Ela permite que os pesquisadores monitorem efetivamente esses biomarcadores visando observar alterações dinâmicas para a exploração adicional das relações entre seus estados e funções celulares relevantes. Endossomas, lisossomos e outras organelas têm um papel fundamental na transdução de sinal e manutenção da homeostase metabólica. Como os pHs dessas organelas muda durante a endocitose, uma detecção rápida e sensível dos valores de pH delas passou a ser o foco da pesquisa sobre o monitoramento dinâmico do processo de endocitose e sobre a exploração de relações entre seus estados e funções celulares.
Em 2016, o Prof. Yiguang Wang da Universidade de Pequim e a equipe de pesquisa do Prof. Jinming Gao, do Centro Médico Sudoeste da Universidade do Texas, publicaram um artigo no qual projetaram uma nanossonda ultrassensível ao pH (HyUPS) com resolução de organela individual. Eles usaram essa nanossonda para monitorar e detectar alterações de pH em endossomas/lisossomos e outras organelas durante a endocitose. A sonda inclui três componentes sensíveis ao pH, correspondendo aos três componentes da endocitose e três intervalos de pH, sendo respectivamente marcados com fluoróforos vermelhos, verdes e azuis. A sonda obteve sucesso no monitoramento dinâmico, em tempo real e multicores da taxa de acidificação nas organelas envolvidas na endocitose de células vivas, proporcionando uma nova ferramenta de formação de imagem para estudos adicionais de doenças de disfunção endossomal/lisossomal.[6]
A formação de imagem com nanossonda em um espécime vivo requer equipamento de formação de imagem em alta velocidade. A abordagem confocal convencional de escaneamento focado em um ponto não é capaz de satisfazer esse requisito. O sistema confocal de formação de imagem de super resolução com disco giratório IXplore SpinSR pode alcançar formação de imagem multicores rápida (200 qps) em qualidade de super resolução (110 nm) (Figura 8). Essas capacidades permitem a captura dos processos dinâmicos rápidos de estruturas finas, fazendo dele uma ferramenta poderosa para que pesquisadores na área de ciências da vida melhorem com facilidade a eficiência no processo de formação de imagem. O exclusivo controlador em tempo real (Real-time controller, RTCe) controla a operação sincronizada de todos os componentes a fim de minimizar o impacto da luz de excitação sobre as amostras. Combinada a objetivas com óleo de silicone projetadas para biópsia em profundidade, essa vantagem viabiliza a formação de imagem em profundidade com precisão e em longo prazo de amostras de células vivas, esferoides e organoides.
A Figura 9 mostra mitocôndrias de célula epitelial tingidas com corante PKMDR, exemplificando as capacidades de formação de imagem em super resolução do sistema IXplore SpinSR. Desenvolvido pelo Professor Zhixing Chen da Universidade de Pequim, o PKMDR é uma sonda mitocondrial que minimiza a fototoxicidade na formação de imagem nanoscópica e com fluorescência.
Sistema confocal de disco giratório IXplore SpinSR
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Figura 8. O sistema de imagem de super-resolução confocal com disco giratório IXplore SpinSR |
Figura 9. Imagem em super-resolução de mitocôndria de célula epitelial tingida com corante PKMDR e obtida usando o sistema IXplore SpinSR, uma objetiva UPLAPO60XOHR e o processamento TruSight™. Imagem cortesia de: Dra. Huiwen Hao, Dr. Junsheng Yang, Prof. Yujie Sun e Prof. Zhixing Chen. Standard Imaging Co., Ltd. e Sun Lab, College of Future Technology, PKU. NanJing GenVivo Biotech Co., Ltd.
Durante a última década, o rápido desenvolvimento da nanotecnologia e das tecnologias de formação de imagem óptica permitiu que a área de aplicações bioquímicas para a formação de imagem fizesse vários avanços importantes usando nanossondas fluorescentes. No entanto, a aplicação de nanossondas fluorescentes ainda encontra limitações decorrentes de biocompatibilidade, presença de comportamento intermitente da fluorescência e outras deficiências. Com a continuidade do desenvolvimento e da integração de nanomateriais e tecnologias de imagens biológicas, síntese química, física teórica e análise de imagem, espera-se que a especificidade, precisão, estabilidade e reprodutibilidade das imagens biológicas obtidas com nanossondas fluorescentes continue melhorando e expandindo seu potencial para desempenhar um papel mais importante em uma ampla gama de campos de pesquisa.
*Este artigo foi atualizado com base no conteúdo original publicado em 6 de outubro de 2022.
Referências:
[2]. Chang, H., Xie, J., Zhao, B., Liu, B., Xu, S., Ren, N., Xie, X., Huang, L., & Huang, W. (2014). Rare Earth Ion-Doped Upconversion Nanocrystals: Synthesis and Surface Modification. Nanomaterials (Basel, Switzerland), 5(1), 1–25.
[3]. Chen, Z., Wu, X., Hu, S., Hu, P., & Liu, Y. Multicolor upconversion NaLuF4 fluorescent nanoprobe for plant cell imaging and detection of sodium fluorescein. J. Mater. Chem. C, 2015, 3, 153-161
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