Formação de imagem profunda de alta resolução sem danificar a amostra

Estruturas do microscópio

Estrutura vertical

A solução da estrutura vertical FV1200MPE é dedicada à execução de tarefas de microscopia multifóton. Esta estrutura permite que os usuários finais criem um sistema ideal enquanto são realizadas experiências que exigem a sincronização da estimulação da luz laser e dos sinais de patch clamp. O condensador de alta NA dedicado detecta sinais de geração do segundo harmônico (GSH) transmitido.

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Estrutura invertida

A estrutura invertida é ideal para a observação do lapso de tempo de espécimes vivos espessos, como culturas de tecidos e culturas de células tridimensionais. O sistema de estrutura invertida também encontra utilidade na observação intravital do lapso de tempo de órgãos e tecidos através de uma janela de corpo.

Saiba mais sobre a estrutura invertida

Sistemas de laser e de escâner

Formação de imagem mais clara e profunda com menos danos

Em microscopia multifóton, a eficiência da excitação de fluorescência é maximizada usando uma largura de pulso curta no plano focal. No entanto, a largura do pulso de um laser de femtossegundos se dispersa à medida que passa pela óptica, alargando a largura do pulso quando o feixe sai de uma objetiva. A óptica com a forma do feixe de laser estabelece uma dispersão compensatória, exatamente o inverso da dispersão produzida pela óptica do microscópio (alteração de frequência negativa), restaurando, assim, a largura de pulso ideal do espécime.

Ajuste de luz personalizado para o feixe de laser saindo

O FV1200MPE está equipado com um AOM para ajustar a luz laser. O AOM permite fazer alterações à intensidade do laser e ligar/desligar rapidamente o laser com controle de microssegundos. Isso permite que o controle da saída do laser restrinja a irradiação para a região de interesse, evitando as áreas envolventes. Em espécimes espessos, a intensidade do laser e as tensões do PTM podem ser ajustadas conforme a profundidade do espécime, permitindo capturar imagens sem alterar o brilho da imagem.

Capacidade de autoajuste do feixe do laser

Para atingir uma excitação multifóton eficiente, o feixe do laser, descrito por uma distribuição de intensidade gaussiana, deve preencher o diâmetro da pupila assim que entrar na objetiva. O expansor de feixe do FV1200MPE ajusta automaticamente o diâmetro do feixe dependendo da objetiva e do comprimento da onda de excitação. Isso otimiza as características do feixe de laser para a microscopia de excitação multifóton.

O novo design do espelho aumenta a eficiência da excitação

Nosso espelho de galvanômetro apresenta um revestimento prateado inovador que fornece características reflexivas excepcionais através de uma largura de banda de luz visível a quase infravermelha. O intervalo de refletividade do escâner XY também foi melhorado – fornecendo até 25% mais de refletividade na faixa de infravermelhos em comparação com espelhos de alumínio convencionais. Adicionalmente, onde for necessária energia absoluta, o aumento da refletividade se traduz em uma melhoria de 50% da eficiência da excitação multifóton em comparação com o FV1000MPE , tornando o espelho ideal para observação profunda.

Sistemas de detecção

Detecção sensível com amplo campo de visualização

Na excitação multifóton, a fluorescência é emitida pelo ponto focal dentro do espécime. Os componentes das células e dos tecidos dispersam luz de tal forma que a mesma surge pela superfície do espécime a alguma distância do feixe incidente. Incorporando um amplo campo de visualização, o FV1200MPE pode capturar a quantidade máxima de sinal fluorescente, incluindo luz dispersada, para fornecer uma formação de imagem de fluorescência altamente eficiente em tecido de dispersão.

Detector de GaAsP sensível para microscópio vertical

Obtenha imagens com uma proporção S/N elevada, mesmo em casos de fluorescência extremamente fraca, com um detector que usa fosfeto de arseneto de gálio selecionado criteriosamente (GaAsP, com 45% de QE).

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Detector de luz de fluorescência refletida

Os sinais fluorescentes não só são extremamente fracos, como também se dispersam em um espécime espesso, causando uma maior degradação da intensidade do sinal. O FV1200MPE usa um detector instalado em uma posição próxima ao espécime para maximizar a eficiência da detecção.

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Detector de luz de fluorescência transmitida

Um condensador de alta NA e um detector de luz de fluorescência transmitida para a formação de imagem multifóton detectam a fluorescência emitida do plano focal e a luz dispersada no espécime. Com esse detector de luz transmitida, a florescência pode ser detectada com um elevado nível de eficiência, especialmente em camadas profundas do espécime.

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Objetivas dedicadas para microscopia multifóton

A difração de luz corrigida fornece uma formação de imagem profunda

As diferenças do índice de refração no espécime criam um problema de formação de imagem interrompendo o ponto focal. As objetivas dedicadas do FV1200MPE compensam as incompatibilidades do índice de refração graças ao seu colar de correção, permitindo a formação de um ponto focal ideal profundo no espécime sem perda de densidade da energia.

Levar a formação de imagem a novas profundidades

A Olympus torna possível uma formação de imagem de alta precisão de espécimes biológicos transparentes em níveis de tecido excepcionalmente profundos com uma solução inovadora. Isso inclui uma objetiva dedicada com 4 mm de distância de trabalho para a formação de imagem multifóton e um agente aquoso inovador que torna transparentes espécimes biológicos.

Saiba mais sobre objetivas multifóton
Saiba mais sobre o agente de compensação óptica SCALEVIEW-A2

Otimização poderosa para uma formação de imagem de alta velocidade

Sistemas de estimulação

Formação e estimulação simultâneas de imagem multifóton

A estimulação da luz laser pode ser ajustada conforme desejado sem limitar o usuário às configurações de formação de imagem. Isso ocorre devido ao segundo escâner (SIM) independente do FV1200 usado para a estimulação da luz laser (disponível como opção). Conectado ao escâner SIM, o segundo laser multifóton fornece estimulação simultânea no mesmo plano focal usado para a formação de imagem.

Sinal de cálcio de uma coluna vertebral dendrítica única examinado por desenjaulamento e fluorescência multifóton.
Na cabeça da coluna vertebral única (vermelho), foi efetuado o desenjaulamento multifóton de glutamato enjaulado e foi injetado glutamato (excitação de 720 nm). Foi efetuado um rastreamento à linha (a linha que liga os 2 triângulos) desde a cabeça dessa coluna vertebral única em direção ao tronco dendrítico. A partir dessas observações, é evidente o fluxo de cálcio no tronco através de receptores NMDA na cabeça da coluna vertebral.

Reimpresso de Noguchi et al. Neuron 46(2005)609-622.
Jun Noguchi, Haruo Kasai
Center for Disease Biology and Integrative Medicine, Faculty of Medicine,
University of Tokyo.

Estimulação de luz visível e multifóton

O software de estimulação de vários pontos (opcional) permite uma comutação de estimulação continuada entre luz IV e visível em uma experiência. Por exemplo, desenjaulamento com excitação multifóton seguido de estimulação da luz visível de rodopsina do canal sem a necessidade de interromper a aquisição de imagem.

Exemplo de DM integrado para a estimulação luminosa

Por exemplo, com o espelho dicromático indicado abaixo, a estimulação pode ser feita com uma luz visível a 488 nm e 559 nm; a excitação pode, então, ser feita com luz IV a 920 nm para permitir a observação.

Formação de imagem versátil e medições

Ampla variedade de modos de rastreamento

Por padrão, o FV1200MPE é fornecido com um AOM e fornece uma boa posição e um bom controle do tempo de formação de imagem e de estimulação luminosa. Usar o rastreamento tornado da Olympus permite um rápido branqueamento e estimulação de luz laser de campos desejados em experiências como as que envolvem FRAP e desenjaulamento.

Optogenética e desenjaulamento de alta velocidade

Os modos de rastreamento raster padrão não são capazes de medir fisiologia de alta velocidade com sinal-ruído alto. O inovador Multi-point Mapping Advanced Software (MMASW) da Olympus fornece uma solução para as medições de alta velocidade mais exigentes. Usando métodos semelhantes a Random Access Scanning e Targeted Path Scanning, os usuários têm liberdade para escolher seus próprios caminhos de estimulação e medição de vários pontos rápidos. Cada posição rastreada pode ser expandida para uma área maior. Espelhos de galvanômetro prateado orientam o rastreamento, assegurando o acesso a todo o campo de visão e uma capacidade de rastreamento multicolorido com excelente produtividade operacional da luz para o laser visível e de IV. Meça as flutuações da rede de células até 101 ciclos por segundo, com uma saída de dados de até 50.000 Hz por posição. O sinal-ruído alto coleta todos os dados de que necessita.
Use a característica Mapeamento para identificar rapidamente posições de flutuação de fluorescência ou áreas de sinal alto e atribuir automaticamente posições a medições de alta velocidade.
Mapeie as respostas celulares ao estímulo simultâneo com o escâner SIM exclusivo da Olympus para experiências de optogenética ou desenjaulamento (apenas FV1200MPE BASIC e TWIN).
Sincronize a detecção com dispositivos de eletrofisiologia ou outros dispositivos externos. Eletrofisiologia de alta velocidade, medições de cálcio, optogenética e experimentos FRAP/FLIP. A estimulação do escâner SIM sincronizada com a formação de imagem assegura respostas celulares durante ou imediatamente após a estimulação ser capturada à medida que ocorre. As posições de estimulação/formação de imagem e os comprimentos de onda do laser podem ser definidos em separado com dois feixes independentes.

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Estimulação laser sincronizada e patch clamping

A unidade analógica do FV1200MPE permite que as tensões sejam convertidas em imagens e manuseadas da mesma forma que imagens de fluorescência. Por exemplo, sinais elétricos medidos por patch clamping durante a estimulação da luz laser podem ser sincronizados com a aquisição de imagem e exibidos com pseudocor.

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Medições rápidas e de eletrofisiologia

O campo de observação está dividido em uma grade e os campos separados são discretamente irradiados com um laser, permitindo a estimulação da luz laser e excluindo a influência do sinal de campos adjacentes. O software de mapeamento e vários pontos habilita a estimulação automática em vários pontos (software opcional).

Compensação de brilho no plano Z

Normalmente, o brilho da amostra diminui ao formar imagens profundas em um espécime espesso. O uso desta função permite alterar a sensibilidade do detector e a potência do laser, formando continuamente uma imagem que corresponda à posição focal, permitindo, assim, uma formação de imagem de alta sensibilidade e precisão sem perder informações sobre a porção espessa do espécime.

Kit de levantamento de altura do braço para trabalhos com pequenos animais

O kit de levantamento de altura do braço oferece 40 mm adicionais de espaço e é montado entre a estrutura do microscópio e o iluminador de luz refletida. Isso facilita experimentos que precisem de pequenos animais.

Várias opções para a configuração do sistema

Sistema M: exclusivo para multifóton com escâner M

O sistema exclusivo multifóton não está equipado com lasers de luz visíveis. Ópticas simples otimizadas para microscopia multifóton permitem um tamanho menor, uma operação mais simples e uma formação de imagem mais profunda no espécime. O sistema usa um espelho de rastreamento de galvanômetro revestido em ouro.

Sistema B: multifóton com escâner padrão

O sistema está equipado com um laser IV para a formação de imagem multifóton e um laser para luz visível, por isso, foi projetado para a formação de imagem profunda através de microscopia multifóton e para a formação de imagem confocal com um laser visível. O sistema foi projetado para uma variedade de formação de imagens, incluindo formação de imagem de células vivas e in vivo.Usar este sistema em conjunto com o combinador de laser duplo permite a formação de imagem multifóton e a estimulação da luz visível.

Sistema S: estimulação de luz laser multifóton

Este sistema está equipado com um laser IV que transmite a luz ao escâner para estimulação. Além da microscopia multifóton geral, o sistema permite a estimulação de luz exata através de excitação multifóton durante a formação de imagem com um laser visível.A microscopia multifóton não permite alguns modos de aquisição de imagem como Controlador de tempo.

Sistema T: formação e estimulação de imagem multifóton

Este sistema sincroniza a luz laser de dois lasers IV independentes para estimulação e formação de imagem. Ele fornece à formação de imagem uma capacidade de visualização profunda no tecido, habilitando, ao mesmo tempo, a estimulação 3D exata com excitação multifóton, por exemplo, ao estimular uma coluna vertebral dendrítica localizada dentro do tecido. A recém-introduzida característica de porta dupla SIM permite que o escâner SIM efetue uma estimulação precisa com laser visível e laser IV.

Sistema de compartilhamento de laser

Este sistema permite que dois microscópios compartilhem um laser único.Exemplo de um sistema B (sistema Básico) compartilhando um laser com um sistema M (sistema exclusivo para Multifóton). Tanto o BX61WI do sistema B como o BX61WI do sistema M compartilham um laser único.

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Lasers visíveis para microscopia confocal padrão

O multicombinador permite combinações com todos os seguintes lasers díodo: 405 nm, 440 nm, 473 nm, 559 nm e 635 nm. O sistema também pode ser equipado com um laser Multi-line Ar e HeNe-G convencional.

Tipo de saída dupla

O multicombinador produz luz laser com duas fibras. A luz pode ser usada para observação e estimulação de luz laser.

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Tipo de saída única

Multicombinador com uma fibra de saída única para a observação de luz visível. O AOTF é o equipamento padrão.

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