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Objetivas de microscópio – Introdução

As objetivas são talvez os componentes mais importantes de um microscópio óptico, uma vez que são responsáveis pela formação da imagem primária e desempenham um papel fundamental na determinação da qualidade das imagens que o microscópio é capaz de produzir. As objetivas são também essenciais para determinar a ampliação de um espécime específico e a resolução na qual pode ser observado pormenorizadamente um espécime no microscópio.

A objetiva é o componente de microscópio óptico mais difícil de projetar e montar, além de ser o primeiro elemento que a luz encontra ao passar do espécime ao plano de imagem. O nome das objetivas vem do fato de serem, por proximidade, o componente mais próximo ao objeto (espécime) observado.

Os grandes fabricantes de microscópio oferecem uma grande variedade de objetivas, que apresenta características ópticas excelentes sob um amplo espectro de condições de iluminação e oferece vários graus de correção para aberrações ópticas primárias. A objetiva ilustrada na Figura 1 é uma apocromática com longa distância de trabalho de 250×, que contém elementos ópticos cimentados em três grupos de dubletos, um grupo de tripleto e três lentes de elemento único internas individuais. A objetiva também tem uma lente frontal hemisférica e uma segunda lente de menisco, que funcionam sincronizadas para auxiliar a capturar raios de luz em uma abertura numérica alta com o mínimo de aberração esférica. Embora não estejam presentes nessa objetiva, muitas objetivas de alta ampliação com mesmo desenho estão equipadas com um conjunto de nosecone retrátil com mola, que protege os elementos frontais da lente e o espécime contra danos de colisões. Os elementos da lente interna são orientados cuidadosamente e bem encaixadas em uma estrutura de latão tubular que é encapsulada pelo barril da objetiva. Parâmetros específicos da objetiva, como abertura numérica, aumento, comprimento do tubo óptico, grau de correção de aberração e outras características importantes, estão impressos ou gravados na parte externa do barril. Embora a objetiva apresentada na Figura 1 seja projetada para operar usando ar como meio de formação de imagem entre a lente frontal objetiva e o espécime, outras objetivas têm elementos de lente frontal que permitem serem imersas em água, glicerina ou um óleo especializado baseado em hidrocarbonetos.

Objetivas modernas, compostas de vários elementos de lente de vidro internos, atingiram um ótimo estado de qualidade e desempenho, e seu nível de correção de aberrações e nivelamento do campo determina a utilidade e o custo de uma objetiva. As técnicas de construção e os materiais usados para fabricar objetivas tiveram grandes avanços nos últimos 100 anos. Hoje, as objetivas são projetadas com ajuda de sistemas CAD usando fórmulas de vidro avançadas com elementos raros de composição uniforme e índices de refração altamente específicos para obtenção de qualidade. Esse melhor desempenho demonstrado usando essas técnicas avançadas permitiu que os fabricantes produzissem objetivas com dispersão muito baixa e corrigidas para a maioria dos artefatos ópticos comuns, como coma, astigmatismo, distorção geométrica, curvatura de campo e aberração esférica e cromática. Agora, as objetivas de microscópio não só são corrigidas para mais aberrações em campos mais amplos, como também os reflexos foram reduzidos drasticamente com um aumento substancial na transmissão da luz, produzindo imagens notavelmente mais claras, definidas e nítidas.

Essas três características cruciais do design da objetiva definem o limite de resolução definitivo do microscópio. Elas incluem o comprimento de onda da luz usada para iluminar o espécime, a abertura angular do cone de luz capturado pela objetiva e o índice de refração no espaço do objeto entre a lente frontal da objetiva e o espécime. A resolução de um microscópio óptico com difração limitada pode ser descrita como a distância mínima detectável entre dois pontos bastante próximos do espécime:

R = λ / 2n(sin(θ))

em que R é a distância de separação, λ é o comprimento de onda de iluminação, n é o índice de refração do meio de formação de imagem e θ é metade da abertura angular da objetiva. Ao examinar a equação, torna-se aparente que a resolução seja diretamente proporcional ao comprimento de onda da iluminação. O olho humano responde à região de comprimento de onda entre 400 e 700 nm, o que representa o espectro da luz visível utilizado para a maioria das observações de microscópio. A resolução também depende do índice de refração do meio de formação de imagem e da abertura angular da objetiva. As objetivas são projetadas para formar imagens de espécimes com ar ou um meio de índice de refração maior entre as lentes frontais e o espécime. O campo de visão é frequentemente bastante limitado e o elemento das lentes frontais da objetiva é colocado perto do espécime com o qual ele precisa entrar em contato óptico. Um ganho na resolução por um fator de aproximadamente 1,5 é obtido quando o óleo de imersão é substituído por ar como o meio de formação de imagem.

O último fator para determinar a resolução de uma objetiva, e talvez o mais importante, é a abertura angular, que tem um limite superior prático de cerca de 72° (com valor de seno de 0,95). Em combinação com o índice de refração, o produto:

n(sin(θ))

é conhecido como abertura numérica (abreviado como AN) e oferece um indicador conveniente da resolução de qualquer objetiva específica. A abertura numérica é geralmente o critério de design mais importante (depois da correção óptica) a ser considerado ao escolher uma objetiva de microscópio. Os valores vão de 0,1 para objetivas com aumento muito pequeno (1× a 4×) até 1,6 para objetivas de alto desempenho que usam óleos de imersão dedicados. Como os valores de Abertura Numérica aumentam para uma série de Objetivas de mesmo aumento, geralmente observamos uma habilidade maior de captação de luz e aumento na resolução. O microscopista deve escolher com cuidado o aumento da objetiva, para que, nas melhores circunstâncias, o detalhe resolvido tenha uma ampliação suficiente para ser visto com conforto, mas não a ponto que o aumento vazio dificulte a observação de pequenos detalhes do espécime.

Assim como o brilho da iluminação em um microscópio é regido pelo quadrado da abertura numérica de trabalho do condensador, o brilho de uma imagem produzida pela objetiva é determinado pelo quadrado da sua abertura numérica. Além disso, o aumento da objetiva também desempenha um papel na determinação do brilho da imagem, que é inversamente proporcional ao quadrado do aumento lateral. O quadrado da abertura numérica/proporção de aumento expressa o poder de captação de luz da objetiva quando utilizada com iluminação transmitida. Como as objetivas de abertura numérica alta são frequentemente melhor corrigidas para aberração, elas também captam mais luz e produzem uma imagem mais brilhante e mais corrigida que é altamente resolvida. Devemos observar que o brilho da imagem diminui rapidamente conforme a ampliação aumenta. Nos casos em que o nível de luz é um fator limitante, escolha uma objetiva com a maior Abertura Numérica, mas com o menor fator de aumento capaz de produzir uma resolução adequada.

As objetivas menos caras (e mais comuns) empregadas na maioria dos microscópios de laboratório são as objetivas acromáticas. Essas objetivas são corrigidas para aberração cromática axial em dois comprimentos de onda (azul e vermelho; cerca de 486 e 656 nm, respectivamente), que são reunidas em um ponto focal comum. Além disso, as Objetivas acromáticas são corrigidas para aberração esférica na cor verde (546 nm; veja a Tabela 1). A correção limitada das objetivas acromáticas pode levar a artefatos substanciais quando os espécimes são examinados e sua imagem é formada por microscopia e fotomicrografia coloridas. Se o foco for escolhido na região verde do espectro, as imagens terão um halo avermelhado magenta (frequentemente chamado de cor residual). As objetivas acromáticas produzem melhores resultados com a luz passando por um filtro verde (frequentemente um filtro de interferência) e usando um filme branco e preto quando essas objetivas são empregadas para fotomicrografia. A falta de correção para nivelamento do campo (ou curvatura do campo) também prejudica as objetivas acromáticas. Nos últimos anos, muitos fabricantes começaram a oferecer correções de campo plano para Objetivas acromáticas e deram a essas objetivas corrigidas, o nome de planacromáticas.

O próximo nível de correção e custo mais altos é encontrado em objetivas chamadas de fluoritas ou semi-apocromáticas (ilustradas pela objetiva central na Figura 2), que recebem esse nome devido ao mineral fluorite, que era usado originalmente na sua construção. A Figura 2 representa as três classes principais de objetivas: As acromáticas com o menor fator de correção, como discutido acima; as fluoritas (ou semi-apocromáticas) com correções esféricas adicionais; e as apocromáticas, que são as objetivas com maior correção disponíveis. A objetiva posicionada mais à esquerda na Figura 2 é uma acromática de 10×, que contém dois dubletos de lente e um elemento de lente frontal. No centro da Figura 2, está ilustrada uma lente fluorita de 10× com vários grupos de lente, incluindo 2 dubletos e um tripleto, além de uma lente frontal hemisférica e uma lente de menisco secundária. À direita, na Figura 2, temos uma objetiva apocromática de 10× que também contém vários grupos de lente e elementos simples. Embora tenham construção semelhante às objetivas fluorita, as lentes têm diferentes curvaturas e espessuras e estão organizadas em uma configuração que é exclusiva das objetivas apocromáticas.

Correção da objetiva para aberração óptica
Objetiva
Tipo
Esférica
Aberração
Cromática
Aberração
Campo
Curvatura
Acromática1 cor2 coresNão
Plana acromática1 cor2 coresSim
Fluorita2–3 cores2–3 coresNão
Plan Fluorita3–4 cores2–4 coresSim
Plana apocromática3–4 cores4–5 coresSim
Tabela 1

Durante a montagem da objetiva, as lentes são primeiro espaçadas estrategicamente e colocadas em montagens de célula e depois colocadas em um cilindro de manga cilíndrica montado internamente dentro do barril da objetiva. As lentes individuais são apoiadas contra um ombro de latão montado com as lentes girando em um torno, e depois polidas com um aro fino de metal que travas as lentes (ou grupos de lentes) na posição. A aberração esférica é corrigida ao selecionar o conjunto ideal de espaçadores para encaixar entre as duas montagens de lente inferiores (as lentes hemisféricas e de menisco). A objetiva é tornada parfocal ao transladar todo o conjunto de lentes verticalmente dentro da manga com contraporcas, de modo que as objetivas alojadas em um porta-objetivas múltiplo possam ser trocadas sem perder o foco. O ajuste de coma é obtido com três parafusos centrais que podem otimizar a posição dos grupos de lentes internas com relação ao eixo óptico da objetiva.

As objetivas fluoritas são produzidas com fórmulas de vidro avançadas que contêm materiais como fluorspar ou substitutos sintéticos mais recentes. Essas novas fórmulas possibilitam melhor muito a correção da aberração óptica. As objetivas fluoritas são semelhantes às acromáticas e também são corrigidas cromaticamente para luz azul e vermelha. Além disso, as fluoritas são também corrigidas esfericamente para duas ou três cores, em vez de uma única cor, pois são acromáticas. A correção superior de objetivas fluoritas em comparação com as acromáticas permite que essas objetivas sejam feitas com uma abertura numérica maior, resultando em imagens mais claras. As objetivas fluoritas também têm melhor poder de resolução que as acromáticas e oferecem maior grau de contraste, que as torna melhor adaptadas que as acromáticas para fotomicrografia colorida na luz branca.

Abertura numérica

Investigue como o tamanho do cone de luz que entra nas lentes frontais da objetiva muda com o valor da abertura numérica da objetiva.

O maior nível de correção (e despesa) é encontrado com as objetivas apocromáticas, ilustradas nas Figuras 2 e 3. As apocromáticas representam as lentes de microscópio com correção mais alta disponíveis no momento, e seu preço alto reflete o design sofisticado e montagem cuidadosa exigida na fabricação. Na Figura 3, comparamos elementos de lente em uma série de objetivas apocromáticas com aumento de 10× a 100×. As objetivas apocromáticas de menor poder (10× e 20×) têm uma distância de trabalho maior e o comprimento geral da objetiva é menor do que em objetivas apocromáticas de maior poder (40× e 100×). Tradicionalmente, as apocromáticas são corrigidas cromaticamente para três cores (vermelho, verde e azul), quase eliminando a aberração cromática, e são corrigidas esfericamente para dois ou três comprimentos de onda (veja a Tabela 1). As objetivas apocromáticas são a melhor opção para fotomicrografia colorida em luz branca. Devido ao nível alto de correção, as objetivas apocromáticas geralmente têm, para dado aumento, aberturas numéricas maiores do que as acromáticas ou fluorites. Muitas das objetivas apocromáticas e fluoritas de alto desempenho mais recentes têm correção para quatro cores (azul escuro, azul, verde e vermelho) ou mais, cromaticamente, e quatro cores esfericamente.

Todos os três tipos de objetiva sofrem de uma curvatura de campo pronunciada e projetam imagens que são mais curvadas que planas, um artefato que aumenta de gravidade em aumentos maiores. Para superar essa condição inerente decorrente as superfícies curvadas das lentes, os projetistas ópticos produziram objetivas corrigidas de campo plano, que produzem imagens com um foco comum ao longo de todo o campo de visão. Objetivas que têm correção de campo plano e baixa distorção são chamadas de planacromáticas, plan fluorista ou planapocromáticas, dependendo do grau de aberração residual. Tal correção, embora cara, é muito valiosa na formação de imagem digital e fotomicrografia convencional.

Curvatura de campo

Uma lente simples foca em pontos de imagem de um objeto plano estendido, como um espécime em uma lâmina de microscópio, em uma superfície esférica que lembra uma tigela curvada. Veja como as aberrações de curvatura de campo degradam as imagens observadas ao microscópio.

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A não correção da curvatura de plano é a aberração óptica mais grave que ocorre nas objetivas fluoritas (semiapocromáticas) e apocromáticas, e era tolerada como um artefato inevitável por muitos anos. Durante o uso de rotina, o campo de visão precisa ver refocado constantemente entre o centro e as bordas para capturar todos os detalhes do espécime. A introdução da correção de campo plano nas objetivas aperfeiçoou o uso para fotomicrografia e microscopia de vídeo. Atualmente, essas correções são o padrão tanto em objetivas de uso geral, quanto em objetivas de alto desempenho. A correção da curvatura de campo adiciona um número considerável de elementos de lente à objetiva, como ilustrado na Figura 4 com uma apocromática simples. A acromática não corrigida à esquerda na Figura 4 contém dois dubletos de lente, além de um elemento frontal de lente fina simples. Em contraste, a plana acromática corrigida à direita na Figura 4 contém três dubletos de lente, um grupo tripleto de lentes central, e uma lente de menisco posicionada atrás da lente frontal hemisférica. A correção do plano, nesse caso, levou à adição de seis elementos de lente colocados em grupos de lentes mais sofisticados, o que aumenta drasticamente a complexidade óptica da objetiva. O aumento significativo nos elementos de lente para correção de plano também ocorre com objetivas de fluorita e apocromáticas, o que frequentemente resulta em um encaixe bem justo dos elementos da lente (veja a Figura 1) na manga interna da objetiva. Em geral, as objetivas planas corrigidas para curvatura de campo sacrificam uma quantidade considerável de distância de trabalho livre, e muitas das versões de aumento alto têm lentes frontais côncavas, que podem ter manutenção e limpeza extremamente difíceis.

Objetivas mais antigas geralmente têm aberturas numéricas menores e estão sujeitas a uma aberração chamada de diferença cromática de aumento, que exige correção por meio do uso de oculares de compensação ou oculares especialmente projetadas. Esse tipo de correção foi prevalente durante o período dos microscópios de comprimento de tubo fixo, mas não é necessária com microscópios e objetivas modernos corrigidos ao infinito. Nos últimos anos, as objetivas dos microscópios modernos têm a correção da diferença cromática do aumento incorporada às próprias objetivas (Olympus e Nikon) ou corrigidas nas lentes de tubo (Leica e Zeiss).

A imagem intermediária em um sistema corrigido ao infinito aparece no comprimento focal de referência (anteriormente, o comprimento do tubo óptico) atrás das lentes de tubo no caminho óptico. Esse comprimento varia entre 160 e 250 mm, dependendo das restrições de design impostas pelo fabricante. O aumento de uma objetiva corrigida ao infinito é calculado dividindo o comprimento focal de referência pelo comprimento focal das lentes objetivas.

Na maioria das aplicações biológicas e petrográficas, um vidro de proteção é utilizado na montagem do espécime para proteger sua integridade e oferecer uma janela nítida de observação. O vidro de proteção age para convergir os cones de luz que se originam de cada ponto no espécime, mas também introduz aberração cromática e esférica (e a consequente perda de contraste) que precisa ser corrigida pela objetiva. O grau de convergência dos raios de luz é determinado pelo índice de refração, dispersão e espessura do vidro de proteção. Embora o índice de refração seja relativamente constante em um lote de vidros de proteção, a espessura pode variar entre 0,13 e 0,22 mm. Outra preocupação é o solvente aquoso ou excesso de meio de montagem que está entre o espécime e o vidro de proteção em preparações úmidas ou espessas. Por exemplo, em soro fisiológico, cujo índice de refração é significativamente diferente da lamínula, a objetiva precisa focar através de uma camada de água de apenas alguns mícrons de espessura, levando a aberrações significativas e desvio da função de dispersão de ponto, que não é mais simétrica acima e abaixo do plano focal. Esses fatores se somam às variações do índice de refração e espessura da lamínula e são muito difíceis para o microscopista controlar.

O meio de formação de imagem entre a lente frontal da objetiva e a lamínula do espécime é também muito importante para a correção de aberração esférica e coma no design de elementos de lente para objetivas. Objetivas de menor aumentos têm aberturas numéricas relativamente baixas e são projetadas para serem usadas secas, apenas com ar como meio de formação de imagem entre a lente frontal da objetiva e o vidro de proteção. A abertura numérica teórica máxima que pode ser obtida com o ar é 1,0. no entanto, na prática, é virtualmente impossível produzir uma objetiva seca com abertura numérica acima de 0,95. O efeito da variação da espessura do vidro de proteção pode ser ignorado para objetivas a seco com abertura numérica abaixo de 0,4, mas, tal desvio se torna significativo em aberturas numéricas acima de 0,65, em que flutuações de até 0,01 mm podem introduzir aberração esférica. Isso representa problemas com apocromáticas, que precisam usar distâncias de trabalho muito pequenas no ar e que contêm correções sensíveis para aberração esférica, que tendem a dificultar a obtenção de imagens nítidas.

Lamínula de proteção

Investigue como elementos de lentes internas em uma objetiva a seco de abertura numérica alta podem ser ajustados para corrigir flutuações na espessura da lamínula.

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Para remedir isso, muitas objetivas a seco apocromáticas são equipadas com colares de correção, que permitem ajustes para corrigir aberração esférica com a correção de variações na espessura da lamínula (veja a Figura 5). A correção óptica da aberração esférica é obtida ao girar o colar, o que faz com que dois dos grupos de elementos de lente na objetiva se aproximem ou se afastem. A objetiva à esquerda na Figura 5 teve o colar de correção ajustado para uma lamínula com espessura de 0,20 mm com a aproximação dos elementos de lente ajustáveis. Em contraste, a objetiva à direita na Figura 5 teve os elementos de lente ajustáveis separados por uma distância maior para compensar as lamínulas muito finas (0,13 mm). A maioria das objetivas de colar de correção projetadas para microscópio vertical de luz transmitida tem uma faixa de ajuste para variações da espessura da lamínula, entre 0,10 e 0,23 mm. Muitas objetivas especializadas de contraste de fase projetadas para observar espécimes de cultura de tecidos com um microscópio invertido têm uma faixa de compensação ainda maior de 0 a 2 mm. Isso permite que os espécimes sejam visualizados através da parte inferior da maioria dos frascos de cultura, que frequentemente têm flutuações drásticas de espessura nessa faixa de tamanho. Espécimes não cobertos, como esfregaços de sangue, também podem ser observados com objetivas de colar de correção quando o ajuste é zerado para levar em conta a ausência da lamínula.

As objetivas a seco de alta abertura numérica sem um colar de correção frequentemente produzem imagens de qualidade inferior àquelas com abertura numérica menor em que a espessura da lamínula é uma preocupação menor. Por esse motivo, muitas vezes, é prudente escolher uma objetiva com aumento (e abertura numérica) menor para obter melhor contraste sem os artefatos resultantes da introdução das flutuações da lamínula. Por exemplo, uma objetiva de 40× com abertura numérica de 0,65 pode conseguir produzir melhores imagens com melhor contraste e clareza do que uma objetiva de 60× com abertura numérica de 0,85, mesmo que o poder de resolução da objetiva com maior aumento seja teoricamente maior.

A espessura padrão da lamínula é 0,16 mm, o que é designado como um vidro de proteção número . Infelizmente, nem todos as lamínulas 1½ são fabricados com essa tolerância rigorosa (eles variam entre 0,16 e 0,19 mm) e muitos espécimes têm um meio entre eles e da lamínula. A lamínula pode ser compensada com o ajuste do comprimento do tubo mecânico do microscópio, ou (como discutido anteriormente) pela utilização de colares de correção especializados que mudam o espaçamento entre elementos críticos dentro do barril da objetiva. O colar de correção é utilizado para ajustar essas diferenças sutis para garantir desempenho ideal da objetiva. A utilização correta de lentes objetivas com colares de correção exige que o microscopista seja experiente e fique atento o suficiente para reajustar o colar usando critérios de imagem adequados. Na maioria dos casos, o foco pode mudar e a imagem pode vagar durante o ajuste do colar de correção. Siga as etapas listadas abaixo para fazer pequenos ajustes incrementais no colar de correção de uma objetiva ao mesmo tempo que observa as mudanças na imagem do espécime.

  • Posicione o colar de correção de modo que a marca do indicador no barril da objetiva coincida com a marca de régua de 0,17 mm gravada na estrutura do colar.
  • Coloque o espécime na platina e focalize o microscópio em um pequeno detalhe do espécime.
  • Gire o colar de correção ligeiramente e focalize novamente a objetiva para determinar se a imagem melhorou ou piorou. Devido ao fato que a maioria das preparações de espécime sofrem com sanduíches muito espessos da lamínula e meio, inicie o experimento de rotação com valores de compensação maiores (0,18–0,23).
  • Repita a etapa anterior para determinar se a imagem está melhorando ou piorando conforme o colar de correção é girado em uma única direção.
  • Se a imagem piorou, siga as mesmas etapas e gire o colar de correção na direção oposta (em direção aos valores menores) para encontrar a posição que oferece resolução e contraste melhores.

A abertura numérica da objetiva pode ser dramaticamente aumentada se a objetiva for projetada para ser usada com um meio de imersão, como óleo, glicerina ou água. Ao usar um meio de imersão com índice de refração semelhante ao da lamínula de vidro, elimina-se quase toda a degradação da imagem devido às variações de espessura do vidro de proteção, já que os raios de grande obliquidade não sofrem mais refração e são capturadas mais prontamente pela objetiva. Óleos de imersão comuns têm índice de refração de 1,51 e uma dispersão semelhante àquela das lamínulas. Os raios de luz que passam pelo espécime encontram um meio homogêneo entre a lamínula e o óleo de imersão e não sofrem refração ao entrar na lente, apenas ao deixar sua superfície superior. Assim, se o espécime for colocado no ponto aplanático (no ponto focal e no centro do campo) da primeira lente objetiva, a formação de imagem dessa parte do sistema de lentes fica totalmente livre de aberração esférica.

O design geral de uma objetiva de imersão em óleo prática inclui um elemento de lente Frontal hemisférica, seguida por uma lente de menisco positiva e um dubleto de lente. A Figura 6 apresenta as refrações aplanáticas que ocorrem nos primeiros dois elementos de lente em uma objetiva de imersão em óleo apocromática. O espécime fica entre a lâmina de microscópio e a lamínula no ponto P, o ponto aplanático do elemento de lente hemisférica. Os raios de luz na parte de trás da lente hemisférica parecem ter origem no ponto P(1), que também é o centro de curvatura da primeira superfície da lente do menisco. Os raios de luz refratados entram na lente de menisco por toda a extensão do raio da primeira superfície e não sofrem refração nessa superfície. Na parte traseira da lente de menisco, os raios de luz são refratados de forma aplanática para que pareçam divergir do ponto P(2). A refração dos raios de luz nas superfícies do grupo de lentes subsequente na objetiva completam a convergência dos raios de luz que têm origem no ponto P, formando assim a imagem intermediária.

Lentes objetivas de imersão em óleo adequadamente projetadas são também corrigidas para defeitos cromáticos introduzidos pelos primeiros dois elementos de lente, ao mesmo tempo que introduzem um valor mínimo de aberração esférica. O fato de que o cone de luz converge parcialmente antes de entrar no primeiro elemento de lente ajuda a controlar a aberração esférica. Deve-se notar que empregar uma objetiva de imersão em óleo sem aplicar óleo entre a lamínula e os dois primeiros elementos de lente resulta em imagens defeituosas. Isso se deve à refração que ocorre na superfície das lentes frontais, que introduzem aberração esférica que não pode ser corrigida pelos componentes de lente subsequentes na objetiva.

As vantagens das objetivas de imersão em óleo serão altamente comprometidas se o fluido de imersão errado for usado. Os fabricantes de microscópio produzem objetivas com tolerâncias restritas a índice de refração e dispersão, o que exige corresponder o valor no líquido colocado entre a lamínula e as lentes frontais da objetiva. Aconselhamos empregar apenas o óleo projetado pelo fabricante da objetiva e não misturar óleos de imersão de outros fabricantes para evitar artefatos desagradáveis, como cristalização ou separação de fase.

Objetivas que usam água e/ou glicerina como meio de formação de imagem também estão disponíveis para aplicações com células vivas em cultura ou seções de tecido imersas em solução salina fisiológica. Lentes de imersão apocromáticas em água são equipadas com colares de correção e aberturas numéricas até 1,2, ligeiramente menores que as correspondentes de imersão em óleo. Essas objetivas permitem que os microscopistas foquem através de até 200 mícrons de meio aquoso e ainda mantenham uma correção óptica excelente. O lado negativo é que as lentes de imersão em água com alta Abertura numérica custam frequentemente muitos milhares de dólares e a imagem ainda pode degradar quando a objetiva é focada profundamente através de tecido ou partes celulares refratáveis. Para mais detalhes sobre objetivas de imersão em óleo, glicerina e água, acesse nossa seção em meios de imersão no primer de microscopia.

Óleo de imersão e índice de refração

Veja como variações no índice de refração do meio de formação de imagem afetam a capacidade de uma objetiva capturar os raios de luz que saem do espécime.

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Há muitas informações inscritas no barril da objetiva, conforme discutido na nossa seção sobre especificações e identificação das objetivas. Brevemente, cada objetiva tem um aumento inscrito (ex.: 10×, 20× ou 40× etc.); o comprimento do tubo para o qual a objetiva foi projetada para oferecer as melhores imagens (geralmente 160 mm ou o símbolo grego de infinito); e a espessura da lamínula que protege o espécime, que se supôs que tivesse um valor constante pelo projetista na correção da aberração esférica (geralmente 0,17 mm). Se a objetiva for projetada para operar com uma gota de óleo entre ela e o espécime, ela terá a gravação OIL ou OEL ou HI (imersão homogênea). Caso essas últimas designações não estejam gravadas na objetiva, ela foi projetada para ser usada seca, com ar entre a parte inferior da objetiva e o espécime. As objetivas sempre possuem gravadas também o valor da abertura numérica (AN). Isso pode variar de 0,04 para objetivas de baixo aumento até 1,3 ou 1,4 para objetivas apocromáticas de alto aumento de imersão em óleo. Se não houver qualquer designação de maior correção na objetiva, se pode supor que ela é acromática. Objetivas mais altamente corrigidas têm inscrições como "apochromat" ou "apo", "plan", "FL", "fluor" etc. Muitas vezes, as objetivas mais antigas têm comprimento focal (distância da lenta à imagem) gravado no barril, que é uma medida do aumento. Em microscópios modernos, a objetiva é projetada para um comprimento de tubo óptico específico, por isso, se torna redundante incluir o comprimento focal e o aumento no barril.

A Tabela 2 lista a distância de trabalho e a abertura numérica como função do aumento para as quatro classes mais comuns de objetivas: acromáticas, planacromáticas, plana fluorita e planapocromáticas. Observe que as objetivas a seco têm um valor de abertura numérica inferior a 1,0 e apenas objetivas projetadas para meio de imersão líquida têm uma abertura numérica que ultrapassa esse valor.

Especificações da objetiva por aumento
AumentoAbertura numéricaDistância de trabalho (mm)
Acromática
0,1030,00
10×0,256,10
20×0,402,10
40×0,650,65
60×0,800,30
100× (óleo)1,250,18
Plana acromática
0,5×0,027,00
0,043,20
0,067,50
0,1030,00
10×0,2510,50
20×0,401,30
40×0,650,57
50× (óleo)0,900,40
100× (óleo)1,250,17
40×0,650,48
100×0,900,26
Plana fluorita
0,1317,10
10×0,3016,00
20×0,502,10
40×0,750,72
40× (óleo)1,300,2
60×0,850,3
100× (seco)0,900,30
100× (óleo)1,300,20
100× (óleo com íris)0.5-1.30,20
Plana apocromática
0,108,50
0,2015,70
10×0,454,00
20×0,751,00
40×0,950,14
40× (óleo)1,000,16
60×0,950,15
60× (óleo)1,400,21
60×
(imersão em água)
1,200,22
100× (óleo)1,400,13
100× (óleo NCG)1,400,17
NCG = Sem lamínula
Tabela 2

Quando um conjunto de objetivas correspondentes do fabricante, por exemplo, objetivas acromáticas de vários aumentos (um único subconjunto das objetivas listadas na Tabela 2), é montado na porta-objetiva, ele é geralmente desenhado para projetar uma imagem aproximadamente no mesmo plano do tubo do corpo. Assim, trocar de objetiva girando o porta-objetiva exige apenas utilização mínima do botão de ajuste fino para restabelecer o foco nítido. Tal conjunto de objetivas é descrito como sendo parfocal, uma conveniência útil e um recurso de segurança. Conjuntos de objetivas correspondentes também são projetados para serem paracêntricos, de modo que um espécime centralizado no campo de visão de uma objetiva permaneça centralizado quando o porta-objetiva é girado para uso de outra objetiva.

Por muitos anos, todas as lentes objetivas projetadas para aplicações biológicas da maioria dos fabricantes se conformavam com um padrão internacional de distância parfocal. Assim, a maioria das objetivas tinha uma distância parfocal de 45 mm e era considerada intercambiável. Com a migração para comprimentos de tubo com correção ao infinito, um novo conjunto de critérios de design surgiu para corrigir aberrações na objetiva e nas lentes do tubo. Com a maior demanda de aumento de flexibilidade para acomodar a necessidade de distâncias de trabalho cada vez maiores com aberturas numéricas e tamanhos de campo maiores, a intercambiabilidade entre as objetivas de diferentes fabricantes desapareceu. Um exemplo dessa transição é o Sistema óptico moderno da Nikon CFI-60 que apresenta objetivas, lentes de tubo e oculares "sem cromo". Cada componente no sistema CFI-60 é corrigido separadamente sem um ser utilizado para atingir a correção do outro. O comprimento do tubo é definido para o infinito (caminho óptico paralelo) usando uma lente de tubo, e a distância parfocal aumentou para 60 mm. Mesmo o tamanho da rosca de montagem da objetiva foi alterado de 20,32 para 25 mm para atender aos novos requisitos do sistema óptico.

O diâmetro de campo em um microscópio óptico é expresso pelo número de campo de visão ou simplesmente o número de campo, que é o diâmetro do campo de visão expresso em milímetros e medido no plano de imagem intermediário. O diâmetro de campo no plano do objeto (espécime) se torna o número de campo dividido pelo aumento da objetiva. Embora o número de campo seja frequentemente limitado pelo aumento e pelo diâmetro do diafragma de campo da ocular, há claramente um limite que também é imposto pelo design da objetiva. Nas primeiras objetivas para microscópio, o diâmetro de campo máximo utilizável era limitado a cerca de 18 mm (ou consideravelmente menos para oculares de alta ampliação), mas as objetivas planapocromáticas modernas e outras objetivas de campo plano frequentemente têm um campo utilizável entre 22 e 28 mm (ou mais) quando combinadas com oculares de campo amplo. Infelizmente, o número de campo útil máximo geralmente não está gravado no barril da objetiva e também não é comumente listado em catálogos de microscópio.

O intervalo axial, pelo qual uma objetiva pode ser focalizada sem mudança apreciável na nitidez da imagem, é chamado de profundidade do campo da objetiva. Esse valor varia radicalmente entre objetivas de abertura numérica alta e baixa, geralmente decrescendo à medida que a abertura numérica aumenta (veja a Tabela 3 e a Figura 7). Em aberturas numéricas altas, a profundidade do campo é determinada principalmente pela óptica de ondas, enquanto que em aberturas numéricas menores, o "círculo de confusão" da óptica geométrica domina. A profundidade de campo total é dada pela soma das profundidades de campo óptico de ondas e geométrico como:

dtot = λn/NA2 + (n/M•NA)e

em que λ é o comprimento de onda da iluminação, n é o índice de refração do meio de formação de imagem, NA é a abertura numérica da objetiva, M é o aumento lateral da objetiva e e é a menor distância que pode ser resolvida por um detector colocado no plano da imagem da objetiva. Observe que a profundidade de campo limitada pela difração (o primeiro termo do lado direito da equação) é inversamente proporcional ao quadrado da abertura numérica, enquanto que o limite lateral da resolução é reduzido com a primeira potência da abertura numérica. O resultado é que a resolução axial e a espessura das seções ópticas são afetadas pela abertura numérica do sistema muito mais que a resolução lateral do microscópio (veja a Tabela 3).

Profundidade do campo e profundidade da imagem
AumentoAbertura numéricaProfundidade do campo
(
µm)
Profundidade da imagem
(mm)
0,1015,50,13
10×0,258,50,80
20×0,405,83,8
40×0,651,012,8
60×0,850,4029,8
100×0,950,1980,0
Tabela 3

A distância do espaço entre a superfície mais próxima do vidro de proteção e a lente frontal da objetiva é chamada de distância de trabalho. Em situações em foi projetado que a imagem do espécime será formada sem uma lamínula, a distância de trabalho é medida na superfície real do espécime. Geralmente, a distância de trabalho diminui em uma série de objetivas correspondentes conforme o aumento e a abertura numérica aumentam (veja a Tabela 2). As objetivas projetadas para ver espécimes com o ar como meio de formação de imagem devem ter as maiores distâncias de trabalho possíveis, desde que os requisitos de abertura numérica sejam cumpridos. Objetivas de imersão, por outro lado, devem ter distâncias de trabalho menores para conter o líquido de imersão entre a lente frontal e o espécime. Muitas objetivas projetadas com distâncias de trabalho menores têm um batente de retração com mola, que permite retrair o conjunto de lentes frontais ao empurrá-lo para dentro do corpo da objetiva e girá-lo para travar. Tal acessório é conveniente quando a objetiva é girada no porta-objetiva para que não arraste o óleo de imersão ao longo da superfície de uma lâmina limpa. Girar o batente de retração na direção oposta libera o conjunto de lentes para uso. Em algumas aplicações (veja abaixo), uma distância de trabalho maior e livre é indispensável, e objetivas especiais são projetadas para esse uso, apesar da dificuldade que envolve obter aberturas numéricas grandes e o grau necessário de correção óptica.

Um dos avanços mais significativos em design de objetivas em anos recentes foi a melhoria na tecnologia de revestimento antirreflexo, que ajuda a reduzir reflexões indesejadas que ocorrem quando a luz passa por um sistema de lentes. Cada interface ar-vidro não revestida pode refletir entre 4 e 5% de um feixe de luz incidente normal à superfície, resultando em um valor transmissão entre 95 e 96% na incidência normal. A aplicação de um revestimento antirreflexo com espessura de um quarto do comprimento de onda com o índice de refração apropriado pode reduzir esse valor em 3 a 4%. Conforme as objetivas se tornam mais sofisticadas com um número cada vez maior de lentes, a necessidade de eliminar reflexos internos cresce na mesma medida. Algumas lentes objetivas modernas com alto grau de correção podem conter até 15 lentes com muitas interfaces ar-vidro. Se as lentes não tiverem revestimento, apenas as perdas de reflexão dos raios axiais reduziriam o valor de transmitância em cerca de 50%. Os revestimentos de lente de uma camada que eram utilizados para reduzir o brilho e melhorar a transmissão foram suplantados por revestimentos de várias camadas que produzem valores de transmissão que ultrapassam 99,9% no intervalo do espectro visível.

A Figura 8 ilustra um esquema das ondas de luz que refletem e/ou atravessam um elemento de lente revestido com duas camadas antirreflexo. A onda incidente atinge a primeira camada (Camada A na Figura 3) em um ângulo que faz com que parte da luz seja refletida (R(o)) e parte seja transmitida através da primeira camada. Ao encontrar a segunda camada antirreflexo (Camada B), outra parte da luz é refletida no mesmo ângulo e interfere na luz refletida da primeira camada. Parte das ondas de luz restantes continua na superfície de vidro onde são, novamente, refletidas e transmitidas. A luz refletida pela superfície de vidro interfere (de forma construtiva e destrutiva) na luz refletida nas camadas antirreflexo. Os índices de refração das camadas antirreflexo são diferentes do índice refração do vidro e do meio circundante (ar). À medida que as ondas de luz passam pelas camadas antirreflexo e pela superfície do vidro, a maioria da luz (dependendo do ângulo de incidência, geralmente perpendicular às lentes na microscopia óptica) é transmitida através do vidro e focada para formar uma imagem.

O fluoreto de magnésio é um dos muitos materiais utilizados em revestimentos antirreflexos ópticos de camada fina, mas a maioria dos fabricantes de microscópios produzem as próprias fórmulas de revestimento patenteadas. O resultado geral é uma melhoria drástica no contraste e na transmissão de comprimentos de onda visível com uma interferência destrutiva simultânea nas frequências relacionadas harmonicamente que estão fora da faixa de transmissão. Esses revestimentos especializados podem ser facilmente danificados e o microscopista deve estar ciente dessa vulnerabilidade. Revestimentos antirreflexos multicamadas têm uma tonalidade ligeiramente verde, ao contrário da tonalidade púrpura da revestimentos de uma camada. Essa observação pode ser usada para distinguir os dois revestimentos. A camada da superfície dos revestimentos antirreflexos usados em lentes internas é muito mais macia que os revestimentos correspondentes projetados para proteger as superfícies externas da lente. Deve-se ter cuidado ao limpar superfícies ópticas que foram revestidas com filmes finos, especialmente se o microscópio foi desmontado e os elementos internos da lente estão sujeitos a exames minuciosos.

O comprimento focal de um sistema de lentes é definido como a distância do centro da lenta até o ponto em que raios paralelos são focados no eixo óptico (frequentemente chamado de ponto focal principal). Uma perpendicular do plano imaginária até o ponto focal principal é chamado de plano focal do sistema de lentes. Cada lente tem dois pontos focais principais para a entrada de luz em cada lado, um na frente e outro atrás. Por convenção, o plano focal da objetiva que está mais próximo do elemento da lente frontal é conhecido como o plano focal frontal e o plano focal localizado atrás da objetiva é chamado de plano focal traseiro. A posição atual do plano focal traseiro depende da construção da objetiva, mas fica geralmente situado dentro do barril em objetivas com alta ampliação. Objetivas de menor aumento frequentemente têm um plano focal traseiro externo ao barril, localizado na área roscada ou dentro do porta-objetiva do microscópio.

Conforme os raios de luz passam por uma objetiva, eles são restritos pela abertura traseira ou pupila de saída da objetiva. O diâmetro dessa abertura varia entre 12 mm para objetivas de baixa ampliação até 5 mm para as objetivas apocromáticas de maior potência. O tamanho da abertura é extremamente importante para aplicações de epi-iluminação que dependem da objetiva para agir como sistema de formação de imagem e condensador, em que a pupila de saída também se torna uma pupila de entrada. A imagem da fonte de luz precisa preencher completamente a abertura traseira da objetiva para produzir uma iluminação uniforme em todo o campo de visão. Se a imagem da fonte de luz for menor que a abertura, o campo de visão apresentará uma formação de vinhetas devido à iluminação irregular. Por outro lado, se a imagem da fonte de luz for maior que a abertura traseira, alguma luz não entrará na objetiva e a intensidade da iluminação será reduzida.

Concluindo, o desenvolvimento de objetivas de alta qualidade para microscópio começou com Ernst Abbe, que criou pela primeira vez objetivas apocromáticas e oculares de compensação no final da década de 1880, em colaboração com Carl Zeiss e Otto Schott. O grande avanço seguinte no design de objetivas foi a construção das primeiras objetivas planas acromáticas e objetivas apocromáticas no final dos anos 1930. Mais recentemente, o desenvolvimento de elementos ópticos "sem cromo" (CF) por Zenji Wahimoto (Nikon) e Horst Riesenberg (Zeiss) levou a uma nova revolução no design de objetivas de microscópio.

Muitas objetivas para microscópio em produção atualmente oferecem um baixo grau notável de aberração e outras imperfeições, desde que a objetiva correta seja escolhida e utilizada corretamente. Mesmo assim, o microscopista precisa ter consciência de que as objetivas não foram fabricadas para serem perfeitas de todos os pontos de vista, e sim para atender certo conjunto de especificações dependendo do uso previsto, das restrições nas dimensões físicas e da faixa de preço. Por este motivo, objetivas construídas com diferentes graus de correção para aberração esférica e cromática, tamanho e nivelamento de campo, comprimentos de onda de transmissão, liberdade de fluorescência, birrefringência e outros fatores contribuem para o ruído de fundo. Além disso, elas são projetadas para serem usadas sob certas condições limitadas, como comprimentos de tubo e lentes de tubo específicos, tipo e espessura do meio de imersão e lamínulas, faixas de comprimento de onda, tamanhos de campo, tipos de oculares e condensadores especiais. O objetivo final do microscópio óptico é fornecer ampliação útil que permita que espécimes diminutos sejam observados em grande detalhe, expondo assim um mundo oculto de objetos invisíveis que ficariam sem serem vistos.

Autores colaboradores

Kenneth R. Spring – consultor científico, Lusby, Maryland, 20657.

H. Ernst Keller - Carl Zeiss Inc., One Zeiss Dr., Thornwood, NY, 10594.

Michael W. Davidson - National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., The Florida State University, Tallahassee, Flórida, 32310.

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