Os microscópios de varredura a laser usam iluminação com laser para fazer a varredura de cada ponto das amostras e gerar imagens tridimensionais com alta resolução e alto contraste. Entre os microscópios de varredura a laser, dois tipos comuns incluem os microscópios confocais de varredura a laser e os microscópios multifóton de varredura a laser. Embora ambos usem laser para excitar a amostra, há algumas diferenças básicas entre eles. Nesta página, vamos explicar sobre o funcionamento dos microscópios confocal e multifóton de varredura a laser, suas aplicações e os tipos de imagens que eles podem criar.
Microscópios confocais de varredura a laser | Microscópios multifóton de varredura a laser |
Os microscópios confocais de varredura a laser funcionam usando um laser de onda contínua (Continuous Wave, CW) de comprimento curto de onda para promover uma luz de excitação de alta intensidade a fim de iluminar a amostra. Primeiramente, esse laser é refletido em um espelho dicroico e, em seguida, é refletido em outros dois espelhos responsáveis por fazer a varredura do laser em uma amostra corada. Quando excitado pelo laser, o corante na amostra fluorescente emite uma luz de comprimento longo de onda que passa por um processo inverso de varredura nos espelhos anteriormente usados para fazer a varredura da luz de excitação. Depois, a luz emitida passa pelo espelho dicroico, onde é focada em um pinhole e coletada e medida pelo detector. O detector está conectado a um computador que constrói uma imagem digital tridimensional ponto a ponto. Como o pinhole bloqueia qualquer fluorescência externa ao foco, a imagem resultante é altamente detalhada. A microscopia confocal de varredura a laser tem como princípio o posicionamento do foco do laser e do detector no mesmo ponto da amostra, com a mudança desse ponto para a criação de uma imagem completa da amostra. |
Os microscópios multifóton de varredura a laser funcionam de modo muito semelhante ao dos microscópios confocais de varredura a laser. No entanto, enquanto os microscópios confocais de varredura a laser empregam um laser visível de comprimento curto de onda para excitar a amostra, a microscopia multifóton de varredura a laser usa um laser pulsado infravermelho (IV) de femtossegundo emitido em comprimentos de onda duas vezes maiores do que o necessário para a excitação de um só fóton. Quando absorve dois fótons ao mesmo tempo, o corante na amostra pode emitir fluorescência. Esse fenômeno de absorção de dois fótons acontece exclusivamente na posição de foco, onde a densidade de fótons está altamente concentrada, e só é possível excitar o corante e emitir fluorescência no ponto focal. Portanto, um sistema de microscópio multifóton de varredura a laser não requer uma abertura pinhole para bloquear a fluorescência fora de foco para seu detector não escaneado (Non-descanned detector, NDD), sendo possível detectar a fluorescência do ponto focal de modo eficiente. O motivo por trás do método alternativo de excitação é que o laser de maior comprimento de onda é capaz de penetrar mais profundamente no tecido, viabilizando a observação e a criação de imagens com centenas de micrômetros de profundidade no volume de tecido vivo. Além disso, há uma redução da fototoxicidade em comparação a lasers visíveis de comprimento curto de onda. Desse modo, os microscópios multifóton de varredura a laser são mais adequados para o estudo in vivo de células e tecidos vivos em animais vivos.
Embora geralmente sejam mais usados em pesquisas biológicas, os microscópios confocais de varredura a laser são extremamente úteis em diversas áreas. Graças à capacidade dos microscópios confocais de varredura a laser de criar imagens tridimensionais altamente detalhadas de células, permitindo que os observadores vejam o interior da amostra investigada, eles são frequentemente usados em pesquisas sobre biologia celular, pesquisas sobre câncer e pesquisas com células-tronco. Isso acontece porque os microscópios confocais de varredura a laser têm a capacidade de secionar a luz para produzir imagens de alta resolução de espécimes espessos de tecido sem a necessidade de cortar fisicamente a amostra. Devido à penetração profunda do laser pulsado IV de femtossegundo, os microscópios multifóton de varredura a laser funcionam melhor para a formação de imagens in vivo de animais vivos. Por isso, eles costumam ser escolhidos para pesquisas nas áreas de neurociência e câncer.
Por sua capacidade de realizar a varredura de espécimes ponto a ponto, os microscópios de varredura a laser têm sido cruciais para o estudo de células e tecidos biológicos. Outras vantagens dos microscópios confocais de varredura a laser incluem a capacidade de criar imagens tridimensionais em alta resolução e com alto contraste de células e tecidos sem a necessidade de cortar a amostra fisicamente.
O que torna os microscópios de varredura a laser aptos a produzir imagens de qualidade tão alta é a eficiência para rejeitar luz fluorescente fora do foco por meio do pinhole confocal, de modo que apenas um ponto focado seja coletado pelo detector por vez.
Por esse mesmo motivo, a compilação de uma imagem tridimensional completa de um espécime pode levar muito tempo. No entanto, há melhoras no equipamento disponível que aceleram o processo. Quando comparado à varredura tradicional com galvanômetro, a varredura ressonante pode fornecer velocidade superior de formação de imagem, de até 30 quadros por segundo, para observar eventos rápidos e dinâmicos, como fluxo sanguíneo ou fluxo de íons dentro de células.
Um exemplo de avanço tecnológico que acelerou a capacidade de coleta ponto a ponto dos microscópios de varredura a laser é a introdução do disco giratório. A microscopia confocal de disco giratório está relacionada ao número de pinholes usados para bloquear a luz fluorescente fora do foco. Enquanto a microscopia confocais de varredura a laser usa um só pinhole, a microscopia confocal de disco giratório usa um disco opaco com centenas de pinholes girando em alta velocidade. Isso permite a formação de imagem do espécime inteiro de uma só vez ao invés de ponto a ponto. Essa técnica também pode ajudar a reduzir fotodanos e fotobranqueamento.
Conforme mencionado anteriormente, a alta resolução e o alto contraste das imagens do microscópio confocal com varredura a laser são resultado da passagem de luz fluorescente desfocada pelo pinhole antes de atingir o detector. Depois que a imagem tridimensional é criada, os observadores podem manipular e até mesmo explorar o interior dela em alguns casos.
Embora os nomes tenham alguma semelhança, a principal diferença entre a microscopia de varredura a laser e a microscopia eletrônica de varredura está no método de iluminação da amostra. Enquanto a microscopia de varredura a laser usa um ou mais lasers de excitação, a microscopia eletrônica de varredura, conforme indicado por seu nome, irradia a amostra com feixes de elétrons. Os elétrons refletidos (ou elétrons secundários) da superfície da amostra produzem os sinais que o detector coleta sobre a topografia ou composição da amostra. Como a amostra precisa estar no vácuo, não é possível aplicar a microscopia eletrônica de varredura na observação de amostras vivas.
É possível usar microscópios de varredura a laser com diversas objetivas de ampliação. Logo, o aumento máximo do microscópio de varredura a laser depende da objetiva que esteja sendo usada. Objetivas de baixa ampliação são ideais para a captura da estrutura de uma amostra inteira de tecido. Caso precise capturar a morfologia das células que compõem o tecido, uma objetiva de ampliação média deve bastar. É possível usar as objetivas de alta ampliação para visualizar microestruturas dentro das células que compõem o tecido.
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