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Como o CM20 melhora o processo de cultura de células com dados quantitativos

Introdução

As culturas de células são o ponto de partida para muitos tipos de pesquisa clínica e de ciências da vida. Contudo, o processo de cultura de células atual é ineficaz e está fortemente baseado na experiência e na técnica de pesquisadores qualificados.

No processo atual, os pesquisadores removem células da incubadora e as observam através de um microscópio para avaliar a sua condição. Como esse processo é manual, os resultados variam dependendo da habilidade e da experiência do pesquisador. Em alguns laboratórios, cada pesquisador cultiva várias linhas celulares, tornando difícil manter a qualidade celular necessária para os experimentos. Para obter dados quantitativos, como a quantidade de células, as amostras tinham de ser descamadas e eliminadas após cada medição. E os resultados deste demorado processo são frequentemente dados fragmentários. Para ajudar a enfrentar esses desafios, a Olympus criou o sistema de monitoramento de incubação CM20.

Medição de cultura de células com o sistema de monitoramento CM20

O sistema de monitoramento de incubação CM20 fornece dados de medição não destrutiva enquanto as culturas de células permanecem dentro da incubadora. A tecnologia avançada do escâner fornece medições consistentes e reproduzíveis para reduzir o trabalho e as variações que são comuns quando vários pesquisadores estão realizando as próprias medições (Figura 1).

Figura 1. Medição contínua

Figura 1. Medição contínua

Aquisição contínua de imagens

O sistema é fácil de usar. Para começar, coloque o recipiente da cultura no monitor CM20 e defina a posição e o tempo de observação; em seguida, o sistema inicia a aquisição de imagens (Figura 2). Isso elimina a necessidade de os pesquisadores determinarem um cronograma de observação das culturas e de registrarem manualmente a posição de observação. Além disso, como o sistema monitoriza alterações na cultura com o passar do tempo e nas mesmas posições, é possível confirmar o comportamento celular e os processos de crescimento (Figura 3).

Atual CM20
Tempo de observação Depende do cronograma do pesquisador Intervalos de 3 a 24 horas
Posição de observação Depende da habilidade e da experiência do pesquisador Pontos fixos: 25 pontos (recipiente T75)

Figura 2. Comparação de medições celulares
 

Figura 3. Observação de alterações com o passar do tempo na mesma posição

Figura 3. Observação de alterações com o passar do tempo na mesma posição

Figura 3. Observação de alterações com o passar do tempo na mesma posição

Figura 3. Observação de alterações com o passar do tempo na mesma posição

Dados quantitativos com menos esforço

Usando tecnologias de processamento de imagens e aprendizado de máquina, o sistema de monitoramento CM20 consegue contar células e realizar análises de confluência usando imagens e, posteriormente, criar dados quantitativos com simples definições de parâmetros. Por exemplo, se os parâmetros definidos por pesquisadores experientes forem compartilhados no laboratório, a mesma análise será realizada nas imagens adquiridas para resultados consistentes.
 

Contagem de células

A quantidade de células é calculada através da identificação do núcleo celular usando um algoritmo que reconhece o brilho máximo. É possível realizar ajustes através da alteração dos parâmetros de contraste e do tamanho da célula (Figura 4).

Figura 4. Contagem de células; os núcleos celulares estão marcados em azul

Figura 4. Contagem de células; os núcleos celulares estão marcados em azul

Figura 4. Contagem de células; os núcleos celulares estão marcados em azul

Análise de confluência

A confluência das células é calculada por um algoritmo que usa as características de alterações no brilho entre a porção da célula e a porção de fundo da imagem. Enquanto parâmetro, a parte da célula e o fundo podem ser ajustados através de marcação das imagens e, em seguida, usando aprendizado de máquina (Figura 5).
 

Figura 5. Análise de confluência (à esquerda: imagem marcada para aprendizado de máquina; à direita: o resultado da análise de confluência)

Figura 5. Análise de confluência (à esquerda: imagem marcada para aprendizado de máquina; à direita: o resultado da análise de confluência)

Comparação do crescimento celular com várias linhas celulares iPS

Para testar os resultados provenientes do sistema CM20 e de um pesquisador que monitorizou culturas de células manualmente, trabalhamos com a iPS Portal, Inc. para adquirir dados sobre duas linhas celulares.

Células:células iPS(1231A3,201B7)
Período:1 semana
Recipiente:placa de 6 poços
Pesquisador:1 pessoa

Figura 6. Com uma linha celular por recipiente, foram colocados dois monitores CM20 na incubadora com os recipientes da cultura

Figura 6. Com uma linha celular por recipiente, foram colocados dois monitores CM20 na incubadora com os recipientes da cultura
 

Tendo por base a experiência do pesquisador, a linha celular 1231A3 se multiplicou mais prontamente do que a 201B7. Contudo, uma vez que a aquisição de dados convencional é complexa, a diferença entre as respectivas capacidades de proliferação não estava clara. Para as avaliar, adquirimos imagens e dados de confluência de cada linha celular usando o sistema de monitoramento de incubação CM20.

Figura 7: as informações qualitativas das imagens mostram que a confluência das células difere entre as duas linhas celulares no mesmo dia da cultura.
Figura 8: a partir das informações quantitativas sobre a densidade celular, especialmente após o dia 5, fica claro que a capacidade de proliferação da 1231A3 foi 3% a 6% superior quando comparada com a 201B7.

Figura 7-1. Imagem do dia 7 (1231A3)

Figura 7-1. Imagem do dia 7 (1231A3)

Figura 7-2. Imagem do dia 7 (201B7)

Figura 7-2. Imagem do dia 7 (201B7)

Figura 8-1. A confluência de cada linha celular

Figura 8-1. A confluência de cada linha celular

Figure 8-2. The confluency difference between two cell lines

Figura 8-2. A diferença de confluência entre duas linhas celulares

Tendo por base os dados acima, a diferença na taxa de crescimento entre as duas linhas celulares, que o pesquisador reconheceu através da sua intuição e experiência, foi clarificada pelos dados quantitativos usando o sistema CM20. Isso demonstra um valor importante do sistema de monitoramento de incubação CM20: mesmo que o pesquisador responsável mude, existirá pouca variação nos dados sobre a confluência das células porque todas as culturas são verificadas usando o sistema CM20. Se existir um valor anormal, será fácil olhar para trás e investigar a causa. Além disso, ao adquirir esses dados para cada linha celular, é possível compreender as características das culturas de células, permitindo a realização de transições entre experimentos no momento adequado.

Conclusão

Usando o sistema de monitoramento de incubação CM20, os usuários podem adquirir dados diários sobre a cultura de células de forma fácil e intuitiva (imagens de células, contagem de células e confluência das células). Esses dados permitem aos usuários compreender melhor os fatores que causam variações nas culturas de células e os eliminem, o que contribui para uma melhor qualidade celular e reprodutibilidade de experimentos celulares.

Autor

Shogo Usui
SSPD Electrical Engineering
Olympus Corporation

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