使用CM20细胞培养监控系统Part 2比较人类iPS细胞系：iPS细胞系之间肝类器官分化效率的差异

简介

诱导多能干（iPS）细胞不仅广泛用于基础研究（如专攻细胞分化和器官形成的发育生物学），而且也在转化研究（包括药物发现和诊断工具的开发）中得到普遍应用。构建源自人类iPS细胞的微型组织/器官（称类器官）的技术已迅速发展到可以将三维组织用作人体器官化身的程度。迄今为止，通过健康受试者和全球患者建立的许多iPS细胞系均可用于类器官研究，其目的在于通过评估所产生类器官的功能和个体差异阐明每位患者的疾病基因组背景和疾病易感性。然而，产生靶器官类器官的过程通常需要花费一个多月并且成本高昂。由于所用iPSC细胞系之间分化能力和增殖速率的差异，产生类器官的稳定性和可再现性仍然始终是主要难题。基于来自不同iPS细胞多个样品进行比较是类器官研究发展的障碍之一。

为了解决这一问题，我们在很长一段时间内对iPS细胞进行定量监测，目的在于更好地了解未分化状态的差异以及它们与类器官分化中细胞系依赖性变异的关系。

在来自12个供体的人类iPS细胞系中，尽管在所有接受测试的细胞系中使用了相同的分化方案，但仍有某些细胞系往往无法分化为肝类器官。在本应用指南中，我们通过一项实验更好地了解iPS细胞系分化诱导之前未分化状态下的特性与分化为肝类器官潜力之间存在的关系。

使用CM20系统采集的iPS细胞监控数据评估类器官分化

奥林巴斯CM20细胞培养监控系统让我们能够定量测量培养状态并采集可轻松与过去结果进行比较的测量数据。iPS细胞菌落数和密度数据可以轻松导出为CSV文件供后续详细分析使用。

在本研究中，我们监测了来自12位供体人类iPS细胞系在维持过程中的生长，然后输出每个细胞系的时间依赖性菌落数和密度数据。然后，我们使用我们最近开发的分化方案（*1）获得肝类器官。大约一个月后，我们计算了产生类器官的数量，并测量了白蛋白分泌水平与肝类器官的关系。我们还比较了分化前获得的iPS细胞生长数据与每个细胞系相应肝类器官的数据。

培养方案和数据分析

在无饲养层的条件下，将十二个人类iPS细胞系维持在6孔板内。传代后约一周，使用Accutase将细胞解离成单个细胞，然后接种到新的孔板上。它们经过激活素A和BMP4刺激，从未分化状态分化为定形内胚层。然后，我们使用FGF4和Wnt激动剂对其进行处理，以获得后前肠微球。为了转变为三维培养物，我们将这些微球嵌入基底膜基质Matrigel中，然后在类器官形成的早期阶段注入视黄酸（RA）。将细胞在肝分化培养基中进行长达大约一个月的进一步培养，最终产生肝类器官（图1A）。

接下来，我们对类器官的数量进行计数，并使用ELISA测量所采集培养基样品的白蛋白分泌水平。我们整合了使用CM20监控器采集的未分化iPS细胞增殖数据，并分析了维持培养期间的特征与每个iPS细胞系类器官分化效率之间的相关性（图1B）。 

图1. 监控维持培养过程中的人类iPS细胞并评估肝类器官的分化效率。
（A）用于将人类iPS细胞分化为肝类器官的培养方案。
（B）在来自不同供体12个iPS细胞系iPS细胞维持期间的特征及肝类器官分化效率的比较分析摘要。

在诱导12个人类iPS细胞系分化肝类器官的多次尝试中，我们能够从大多数细胞系获得类器官。但是，iPS细胞系I和J常常无法分化（图2A）。尽管白蛋白分泌量（每个类器官的分泌量）随诱导批次的不同而发生变化，但来自I和J iPS细胞系的肝类器官（其类器官形成效率极低）也显示了存在低水平的白蛋白分泌（图2B）。在具有较高类器官形成效率的细胞系中，我们注意到一些iPS细胞系（如C系）显示了存在相对较低的白蛋白分泌。为了进一步验证这种分化，我们确认了除i和J之外，其他来自iPS细胞系的肝类器官均表达了肝细胞特异性标志物（数据未显示）。这些数据表明，在接受测试的12各细胞系中，I和J iPS细胞系分化为肝谱系的能力有限。

图2. 分化诱导前细胞增殖与人类iPS细胞系肝类器官分化效率的相关性分析。
（A，B）针对每个iPS细胞系使用箱形图绘制了在多重分化诱导实验（A）期间形成的肝类器官数目（A）和白蛋白分泌水平（B）。蓝点对应于多个独立实验中测得的孔数。
（C）显示了在维持期间（倍增时间和早期增殖）和肝类器官分化（类器官数和白蛋白分泌）期间人类iPS细胞生长参数的相关图。

接下来，为了研究分化诱导步骤之前iPS细胞的状态是否影响肝类器官的分化效率，我们分析了CM20监控器采集的增殖参数、形成类器官的数量以及与每次分化诱导实验相对应白蛋白分泌的相关性。我们计算了分化诱导前iPS细胞倍增时间的相关系数（使用CM20监控器提供的融合数据计算）、增殖初期的生长效率（根据Takebe博士定义的公式计算）、产生肝类器官的数量、以及每次实验的白蛋白分泌水平。我们通过分析每次实验的数据集说明批次依赖性的变化（图2C）。尽管产生肝类器官的数量和白蛋白分泌水平与iPS细胞倍增时间几乎没有相关性，但它们与iPS细胞增殖早期的增殖效率参数呈正相关性。这表明，尽管不能使用iPS细胞系之间倍增时间的简单差异确定所产生肝类器官的质量优劣，但在细胞系之间观察到的iPS细胞增殖早期阶段的某些差异可能会影响后续肝类器官分化的效率。

结论

CM20监控器的定量数据让我们能够查看已完成的细胞培养至分化为类器官之前乃至之后的信息。图像和数据方便导出，并且可进行各种分析，有助于在培养过程中获得新的见解。

在本研究中，我们发现iPS细胞在维持过程中，尤其是在生长早期，其生长效率可能会显著影响iPS细胞系肝类器官分化的可变效率。这表明若要生成更稳定和更高质量的肝类器官，关键在于在传代后立即监控iPS细胞的状态，由此了解其是否已经做好诱导分化准备。基于这一相关性，还可通过监视iPS细胞系的增殖状态预测细胞系何时具有较好或较差的分化效率。

奥林巴斯将继续研究使用CM20监控器开发有效的质量控制和数据管理方法。
 

Takebe博士和Yoneyama博士的评论

参考文献：

*1）Ouchi R，Togo S，Kimura M，Shinozawa T，Koido M，Koike H，Thompson W，Karns RA，Mayhew CN，McGrath PS，McCauley HA，Zhang RR，Lewis K，Hakozaki S，Ferguson A， Saiki N，Yoneyama Y，Takeuchi I，Mabuchi Y，Akazawa C，Yoshikawa HY，Wells JM和TakebeT。

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