Life Science Solutions
应用资料

患者源性肿瘤类器官的3D分析


使用NoviSight™3D软件对患者源性肿瘤类器官(PDO)的共聚焦图像进行定量分析,以评估其形态特征和分子靶向药物的抗体结合。

引言

3D组织模型由于能够模仿体内微环境而在药物开发中受到普遍青睐。PDO是描述原始患者药物反应的最强大工具之一。实际上,最近的一项研究表明,PDO的表型和基因型图谱与原始患者肿瘤具有高度相似性。更重要的是,PDO可以以80%以上的准确度预测药物的反应性。 

通过使用Fukushima患者源性肿瘤类器官(F-PDO®)、奥林巴斯FLUOVIEW®FV3000激光扫描共聚焦显微镜和NoviSight 3D分析软件,我们获得针对PDO形态和药物分配的全新工作流程。

3D Analysis of Patient-Derived Tumor Organoids

图形摘要

图形摘要

优点

  •  在将信息保留在其3D结构内的情况下对PDO进行成像和分析。
  • NoviSight软件可以识别3D对象,并对对象进行分类和提供统计数据。

方法

细胞制备

为了制备细胞,我们使用了三种类型的肺F-PDO(RLUN5、RLUN16和RLUN21)。RLUN5通过腺鳞肿瘤生长获得,而RLUN16和RLUN21通过鳞肿瘤生长获得。RLUN21可形成较大的细胞聚集体,并具有比其他细胞更大的细胞质(图1)。

然后将F-PDO离心,进行收集并用4%多聚甲醛过夜固定。表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂Erbitux®和人表皮生长因子受体2(HER2)抑制剂Herceptin®使用HiLyte™Fluor 555(Chemical Dojin)标记,并与F-PDOs一起孵育3小时。

图1 F-PDOs
图1 F-PDOs

免疫染色和透明化

我们采用经过一定修改的Hama等人的免疫染色方案(图2)。将每个固定F-PDO与Ki67抗体(Abcam,16667)过夜孵育,并用AbScale溶液(0.33 M尿素和0.2%Triton-X100)稀释。用AbScale洗涤后,将F-PDO与二级抗体孵育3小时,并用AbScale稀释。用AbScale漂洗液洗涤一小时后,将F-PDOs用4%多聚甲醛重新固定。然后将其用磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液洗涤,并使用带有DAPI的透明化试剂ScaleS4过夜孵育。然后用奥林巴斯FV3000激光扫描共聚焦显微镜对透明化F-PDO进行成像。

图2 F-PDO的免疫染色和透明化方案
图2 F-PDO的免疫染色和透明化方案

成像和分析

我们使用具有2微米Z轴间距的10X或30X放大倍率采集已透明化的F-PDO图像,以进行3D分析。
正确的Zzhou 间距设置对于准确的3D细胞分析非常重要。然后将图像导入NoviSight™软件并以3D格式重构。NoviSight软件可以识别3D对象(如细胞核),并将其转换为定量数据。

结果

F-PDO形态的3D量化

NoviSight软件让我们能够使用多个Z平面图像量化PDO。在对细胞核染色后,分析软件可获取整个结构并实现单细胞的识别(图3A)。其还将每个识别对象作为单个点添加到图形上。当软件将每个核识别为一个对象时,我们可通过对高Ki67荧光强度图进行圈门,以图形和三维展示方式提取Ki67阳性细胞(图3B)。我们使用这些方法量化评估F-PDO的细胞数量、体积、细胞密度和Ki67阳性细胞比例(图3C)。我们发现RLUN21的Ki67阳性比率比其他更低。同样,较大细胞质RLUN21可能会导致其细胞密度低。

A

原始RLUN21
原始RLUN21
细胞核识别
细胞核识别
细胞核识别体积视图
细胞核识别体积视图
RLUN21
RLUN21

B

B. Ki67阳性/阴性细胞按Ki67强度排序。NoviSight软件可以在“图库视图”中显示已圈选出的细胞。

C

C.分类Ki67阳性细胞可以用带有红色圆圈的方式3D显示。

D

RLUN5 RLUN16 RLUN21
细胞数 926 (±719) 294 (±162) 2595 (±1480)
体积(voxels) 3.35.E+06 (±3.26.E+06) 1.08.E+06 (±6.85.E+05) 1.13.E+07 (±9.12.E+06)

图3 F-PDO形态的3D量化图3 F-PDO形态的3D量化
图3 F-PDO形态的3D量化

A. RLUN21的原始3侧视图,NoviSight 3D细胞核识别(3侧和体积视图)和NoviSight结构识别。
B. Ki67阳性/阴性细胞按Ki67强度排序。NoviSight软件可以在“图库视图”中显示已圈选出的细胞。
C.分类Ki67阳性细胞可以用带有红色圆圈的方式3D显示。
D. F-PDO的量化数据。

3D药物分布分析

在我们向每个F-PDO添加经过HyHy-555标记的Erbitux或Herceptin时,Erbitux从其表面均匀结合RLUN21,而Herceptin以不规则方式结合RLUN21。NoviSight™软件的体积识别模块可量化得出抗体药物的阳性体积比(图4A)。由于其可以修改分析目标区域,随后我们使用NoviSight软件量化分析结合方式的差异。为此,我们创建了两个目标区域:从表面以一定百分比缩小的体积区域和具有任意宽度的轮廓体积区域。我们计算了体积中的抗体药物强度。我们还注意到,Erbitux的缩小体积和轮廓线体积之间存在较大的量化差异,而Herceptin仅存在少许差异。这意味着Erbitux牢固结合到RLUN21轮廓区域,而Herceptin在没有偏倚的情况下结合到RLUN21。这种方法让我们能够定量显示抗体药物的分布。

A

 
Erbitux

RLUN5

   
 

RLUN16

 
  

RLUN21


抗体药物体积识别

Antibody drug   volume recognition

 
Herceptin

RLUN5


 

RLUN16

 
 

RLUN21


抗体药物体积识别

Antibody drug   volume recognition


 

抗体阳性体积(%)

Antidoby positive

B

Figure 4 3D quantification of antibody drug distributionRLUN21 Antibody intensity outside/inside region ratio
图4.药物分布的3D量化

A.使用Erbitux或Herceptin的F-PDO的3侧图像,以及抗体药物结合的NoviSight体积识别。该图显示为总体积上的抗体结合体积。
B. NoviSight区域修改模块。NoviSight可以修改分析目标区域,以在有限区域内提供量化数据。

结论

在本研究中,我们发现NoviSight软件可以利用奥林巴斯FV3000激光扫描共聚焦显微镜采集的图像进行形态和药理学上的PDO定量分析。通过将FV3000激光扫描共聚焦显微镜的高分辨率图像与NoviSight软件的高识别精度相结合,我们就可以获得更可靠的量化结果。

参考文献

  1. Vlachogiannis G等人,(2018)转移性胃肠道癌的患者源性类器官模型处理反应。Science.359(6378):920-926. doi: 10.1126 / science.aao2774 
  2. Takahashi等人,(2019年)一种利用肺部患者源性肿瘤类器官评估分子靶向药物的体外系统。Cells.8(5),481. doi:/10.3390 
  3. Tamura H等人。使用类似源组织的患者源性肿瘤类器官特征进行抗癌药评估。Oncol Rep.,40,635-646,2018,
  4. Hama等人,(2016)通过激光扫描共聚焦显微镜对透明化脑部进行深层成像。Nature Protocol Exchange. doi:/10.1038 Mayu

作者

Mayu Ogawa(奥林巴斯)

致谢

本研究得到福岛医科大学Takagi教授的大力支持。若要了解有关F-PDO(Fukushima患者源性类器官)的更多信息,请访问https://www.fmu.ac.jp/home/trc/en/contract-research-provision/f-pdo/

Products used for this application

3D细胞分析软件

NoviSight

  • 从完整结构到亚细胞级别的3D图像识别
  • 统计分析
  • 多种默认检测方法

已经成功添加到您的书签

查看书签关闭

Maximum Compare Limit of 5 Items

Please adjust your selection to be no more than 5 items to compare at once

对不起,此内容在您的国家不适用。