3D活/死细胞测定的分析工作流程
摘要
NoviSight 3D细胞分析软件可通过测量体积、球形度和细胞数等参数提供有关微球和其他3D对象的统计数据。本应用指南将介绍用于活/死微球测定的NoviSight 3D细胞分析工作流程。
引言
使用微球或类器官进行3D高内涵分析（HCA）的难度可能很大。理想情况下，我们可以通过三维方式分析3D样品获得有关形态和内部条件的信息。NoviSight软件的真实3D分析可通过基于连续Z序列荧光图像测量3D样品的体积、细胞数量和细胞状况，从而简化这一过程。另一方面，常规分析使用的单个图像切片（图1，左，2D分析）或使用投影图像（图1，中，2.5D分析）。这两种技术均会从3D样品中丢失诸如空间、形态和体积信息等大量数据（图1）。 在本应用指南中，我们介绍如何使用活/死微球测定法通过NoviSight软件定量分析3D样品。 |
图1 (从左到右)：2D、2.5D和3D分析示意图。 |
方法
样品制备
我们在PrimeSurface®96U孔板（Sumitomo Bakelite）中培养500 HT-29细胞/孔八天以形成微球，然后第二天用NucView® 550 (Biotium)施用不同浓度的星形孢菌素（STS）。NucView 550是caspase-3荧光探针，死细胞核用红色荧光染色。用STS和NucView 550处理后，将HT-29微球用4％多聚甲醛固定并用0.5％Triton X-100 / PBS（-）通透性处理。微球的细胞核在4°C（39.2°F）下用Hoechst 33342过夜染色。染色后，用SCALEVIEW-S4将微球透明化。
成像和分析
我们使用FV3000激光扫描共聚焦显微镜和半复消色差物镜（LUCPLFLN20X）在三个维度上对样品进行成像。采集条件如下所示。Z轴步进为2μm。Hoechst 33342使用405 nm激光（蓝色荧光），NucView 550使用561 nm激光（洋红色荧光）。图2显示为使用显微镜采集的未经处理和经STS处理的微球体积图像。未经处理经8天培养微球的核心区域可能因营养不足或低氧而死亡。总体而言，STS诱导HT-29微球细胞死亡。
图2：使用（右侧）和不使用（左侧）STS的HT-29微球体积视图。
优点
- 轻松进行3D活/死活力测试
- 直观的用户界面可帮助您将Z-堆叠图像转换为可再现的定量数据
3D活/死微球分析策略
使用NoviSight™软件定量分析活/死微球时，需要执行表1中列出的步骤。为了让NoviSight软件能够从Z平面图像以三维方式识别细胞核，可将Z截面的步进设置为3μm，这是检测单个细胞核的最大测量值。
| 步骤 | 详细信息 |
| 样品制备 |
细胞培养和荧光染色
选项：固定和透明化 如果想要分析细胞数，则应对细胞核染色 ↓ |
| 成像 |
获取多个Z序列图像
共聚焦显微镜，多光子显微镜 ↓ |
| 分析 |
1.识别诸如细胞核、体积、细胞器等感兴趣的对象。
2.设置分析参数 3.通过圈门进行图形分析 4.统计分析 |
表1：从样品制备到分析的3D分析工作流程。
NoviSight软件分析步骤
主要对象识别
通过活/死细胞数量评估活/死细胞测定。NoviSight软件可以从细胞核染剂中检测细胞数量。为了识别细胞核，我们使用了专门的NoviSight模块进行核检测：NuclearL。在输入适当的细胞大小、背景强度和Z / XY比（核的Z轴伸长）后，NoviSight软件就可以自动检测3D空间中微球细胞核（图3A）。
分析参数设置
对于使用Hoechst 33342染色的所有细胞核，NucView 550信号强度高的细胞均为死细胞。结果，NoviSight软件能够通过已识别核对象上的CH2（NucView 550）强度等级对活/死细胞进行分类（图3B）。也就是说NoviSight软件仅使用核识别设置就可以对微球活/死细胞进行分类。
图3：识别父母对象。（A）核被NuclearL模块所识别。每个被识别的核均被用彩色圆圈圈上。（B）设定分析参数。例如，参数10是主要对象（核）上CH2（死信号）的最大强度。
核识别完成后，就可以在散点图或直方图中将识别出的核绘制为对象数据。散点图的X轴或Y轴可以根据分析参数进行调整。当将其分别设置在中心X / Y时，将主要对象的中心X / Y绘制在图形上（图4A）。点击图形中的一个点时，NoviSight软件即可指向原始图像中的相同位置（图4B）。
图4：微球的定量分析图像。（A）当分别在X和Y轴上设置中心X和Y分析参数（在图3B中设置）时，在图中绘制每个被识别的核。可以根据需要调整X / Y轴上的分析参数（红色正方形）。（A / B）NoviSight软件可以将分析数据与原始图像以直观方式链接起来。点击图形中已识别核的图形（A，红色箭头）时，相同位置会在原始图像中自动显示（白色箭头）。
图5：细胞分类的图形化分析。
（A）当分别在X和Y轴上设置分析参数平均强度CH2（在图3B中设置）时，该图形以CH2（死信号）平均强度的顺序显示主要对象计数（核）。我们就可以通过CH2强度门控区分活细胞和死细胞。（B）以绿色显示已识别死区的体积视图。
统计分析
NoviSight软件可以同时分析多个样品。来自分析中的定量数据可以作为热图（图6A）显示，也可以导出为CSV文件用于进一步分析。数据也可以在每个门控中输出。这里的数据表明，在HT-29微球中处理各种浓度的STS时，STS以剂量依赖的方式诱导HT-29细胞凋亡（图6B）。
图6：带有或不带STS的HT-29微球活/死细胞分析的定量结果。（A）NoviSight软件输出每个门的定量数据。
数据也可在热图中显示。（B）STS以剂量依赖性方式增加HT-29细胞死亡。
连接数据和图像
数据和图像之间的链接是高内涵分析的主要优势。与酶标仪不同，HCA可以参考原始图像以目视方式确认细胞的形态、位置和强度。NoviSight™软件充分利用了这一功能。例如，当点击特定数据点或对象时，软件可以显示相应的图像（图7），例如：
- 散点图上一个点
- 图片集中一张图
- 热图上一个孔
- 图表中一个数字
散点图上的点图像组视图中的对象图像热图上的孔表格中的数字图7：点击数据点或对象时，NoviSight软件可在相应的图像上显示相同的点。
结论
3D样品的3D定量分析看上去很复杂，但是NoviSight软件可以从头到尾让您的工作流程得到简化。例如，细胞核识别是微球活/死分析的唯一参数。这种简化工作流程也可应用于相关3D模型。
作者
Mayu Ogawa（奥林巴斯）
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