荧光图像分析——微球活/死细胞的测定

可以使用共聚焦显微镜和NoviSight™软件的细胞计数模块定量评估微球内的死细胞比例和药物功效。

目的

从肿瘤表面到核心的距离存在氧气或养分的扩散梯度，这种严酷环境会在肿瘤组织内部深处产生静息细胞或死细胞。微球模型有望模拟肿瘤的微环境。以前，为了观察3D样品的内部必须单独制备每个切片。但是，组织透明化技术的发展现在可以在保留3D样品结构完整性的同时对其内部进行观察。本研究使用NoviSight™软件对用药物处理、固定并制成透明化荧光染色肿瘤微球的共聚焦图像进行3D定量分析。本研究表明，可以使用透明化试剂和NoviSight™软件确认具有药物依赖性的细胞死亡。

样品的制备

将HT-29的细胞悬液以500个细胞/孔的密度种入U底96U孔板（SUMITOMO BAKELITE CO., LTD）内。在细胞培养开始后8天，将各种浓度的星形孢菌素（STS）和NucView550添加到每个孔内。孵育1天后，将细胞使用4％多聚甲醛固定并用0.5％TritonX-100 / PBS透明化。然后，将细胞核在4°C下用Hoechst 33342隔夜染色，并用ScaleS将微球透明化。

结论
荧光图像的采集和分析

使用FV3000激光扫描共聚焦显微镜可以获得上述微球的共聚焦荧光图像。即使没有STS，微球内部深处的细胞核也会被NucView550（A）染色，表明其发生了细胞凋亡。使用NoviSight™软件进行细胞核识别和细胞计数分析可以定量死细胞比率（B），并且确认STS诱导的细胞死亡以具有剂量依赖性的方式发生（C，D）。这些结果证明NoviSight™软件如何帮助实现药物诱导3D细胞死亡的定量评估。

PrimeSurface为Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.的注册商标。
Olympus为注册商标，NoviSight和Insightful Analysis、Intelligent Answers均为Olympus Corporation的商标。