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应用资料

膜形态和分子动力学变化的TIRF成像。


使用奥林巴斯Z漂移补偿系统对细胞膜下膜形态和分子动力学变化进行全内反射荧光(TIRF)成像

简介

当前细胞生物学研究中的一个重要问题是了解与相邻细胞之间细胞间通讯有关生理现象的机制。活细胞显微镜检查能够让研究人员监测细胞膜形态变化以及细胞间粘附位点上局部分子的动力学,是朝向这一目标迈出的充满希望的一步。图1介绍高精度TIRF成像如何实现新型高级细胞研究。使用奥林巴斯电动倒置显微镜IX系列拍摄的图像显示细胞膜下膜的形态和分子动力学的变化。奥林巴斯Z漂移补偿器可在很长一段时间内始终将焦点集中在细胞上,从而能够以如此高的质量捕捉这些图像。该过程显示了TIRF和奥林巴斯Z漂移补偿器对先进活细胞成像的重要意义。

图1.共表达GFP-17和Lifeact-mCherry的Cos-1细胞延时图像。
 图1.共表达GFP-17和Lifeact-mCherry的Cos-1细胞延时图像。

检查FBP17是否募集到质膜取决于肌球蛋白的收缩力所致膜张力的瞬时降低。用肌球蛋白抑制剂blebbistatin处理(175秒)后,FBP17从细胞边缘急剧消失。该效果可通过随后降低由高渗缓冲液引起的膜张力(260秒)挽救,这表明FBP17感应到膜张力并聚集在质膜上。

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the single molecule level under TIRF microscopy

 

共表达GFP-17和Lifeact-mCherry的Cos-1细胞延时影片。

成像系统;
显微镜:研究型倒置显微镜IX81
物镜:PlanApo 100XOTIRFM(100X,NA1.45)
CCD相机:Cascade II冷却的CCD相机(Photometrics)
Z漂移补偿系统:IX-ZDC

图片数据由以下人士提供;
Kazuya Tsujita博士,Toshiki Itoh博士
神户大学高级科学技术组织生物信号研究中心

参考文献;
Nat Cell Biol.2015年6月; 17(6):749-58。doi:10.1038/ncb3162。
J Cell Sci.2013年5月15日; 126(Pt 10):2267-78。doi:10.1242 jcs.12251

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Polarisation of FBP17 is induced by PM tension increase1

 

PM张力增加引起FBP17极化。
通过低渗缓冲液延时显微镜观察到的共表达GFP-FBP17和Lifeact-mCherry的COS-1细胞。该影片每5秒1帧拍摄,并以15 fps速度播放。

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Polarisation of FBP17 is induced by PM tension increase2

 

PM张力降低破坏FBP17极化。
加入高渗缓冲液后,通过延时显微镜观察到共表达GFP-FBP17和Lifeact-mCherry的COS-1细胞。该影片每5秒1帧拍摄,并以15 fps速度播放。

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Polarisation of FBP17 is induced by PtdIns(4,5)P2 liberation

 

FBP17极化是由PtdIns(4,5)P2释放引起的。
加入雷帕霉素后,通过延时显微镜观察到共表达GFP-FBP17、CFP-FKBP-PLCδ1PH结构域和mRFP-FRB-MoA的COS-1细胞。该影片每5秒1帧拍摄,并以15 fps速度播放。

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Polarisation of FBP17 is disrupted by PtdIns(4,5)P2 depletion

 

FBP17极化被PtdIns(4,5)P2耗尽所破坏。
加入雷帕霉素后,通过延时显微镜观察到共表达GFP-FBP17、CFP-PM锚定FRB结构域和mRFP-FKBP-5-磷酸酶结构域的COS-1细胞。该影片每5秒1帧拍摄,并以15 fps速度播放。

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Dynamics of FBP17 at the leading edge

 

处于前沿的FBP17动力学。延时显微镜观察到共表达GFP-FBP17和Lifeact-mCherry的COS-1细胞。该影片每5秒1帧拍摄,并以15 fps速度播放。

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Acute disruption of FBP17 polarity by N-WASP inhibition

 

N-WASP抑制对FBP17极性的急性破坏。加入维斯他汀后,通过延时显微镜观察到共表达GFP-FBP17和Lifeact-mCherry的COS-1细胞。该影片每10秒1帧拍摄,并以15 fps速度播放。

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Acute disruption of FBP17 polarity by Arp2/3 complex inhibition

 

Arp2 / 3复合物抑制对FBP17极性的急性破坏。
加入CK-666后,通过延时显微镜观察到共表达GFP-FBP17和Lifeact-mCherry的COS-1细胞。该影片每10秒1帧拍摄,并以15 fps速度播放。

结论

奥林巴斯活细胞成像解决方案和Z漂移补偿器有助于对细胞过程进行长期成像研究。Z漂移补偿器利用低光毒性的红外(IR)光检测正确的焦点位置,进行自动焦点调整,并通过避免因温度变化等因素所致的焦点漂移而长时间保持精确聚焦。上述实验类型无法使用常规显微镜完成,原因是随着时间推移,焦点漂移将导致所捕捉的图像失焦。Z漂移补偿器可在不失焦的情况下捕捉图像。由此可以帮助对FBP17和Lifeact肌动蛋白标志物在细胞膜下动态变化进行按时间顺序的高精度跟踪。

Products used for this application

TIRF显微成像系统

IXplore TIRF

  • 可用于膜动力学研究和单分子检测的同步多色TIRF
  • 单独穿透深度控制可提供多达四个标记物的精确共定位
  • 充分利用奥林巴斯全球最高1.7*数值孔径的TIRF物镜*(*截至2017年7月25日。根据奥林巴斯的研究)
  • 利用图形化实验管理员(GEM)模块简单直观设置复杂实验
用于超高分辨率成像或全内反射成像的高分辨率物镜

APON-TIRF/UAPON-TIRF/UPLAPO-HR

  • 高数值孔径为高对比度要求的全内反射成像或超高分辨率成像提供极佳的消失波
  • HR系列物镜是世界首款*高平场性下数值孔径达到1.5的平场复消色差物镜。

* 根据奥林巴斯的研究,截止至2018年11月

Z Drift Compensator

IX3-ZDC2

  • 随时保持焦点
  • 易用性设计
  • 专为活细胞影像设计
  • 通过cellSens软件实现高精度,多区域成像

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