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5个加速显微观察实验的实用方法

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单细胞分辨率下的高内涵分析

重新返回实验室时,如何抓紧时间完成被延误的实验就会成为普遍存在的问题。尽管可能由于社交间隔已经浪费了宝贵的时间,但仍有一些巧妙的办法可以帮助您加快实验以确保进度。

基本策略就是快速或同时展开工作,或者将这两种方法结合。可是如何才能做到呢?答案就是学习高内涵或高通量实验独特方法所使用的概念,并将其应用到您自己的项目中。

这里为您介绍加速显微观察实验的五种实用方法:

1.观察更多样品。

如果需要观察两个以上的载玻片或两个培养皿,为什么不同时对其进行观察呢?

毕竟做起来非常简单。倒置显微镜载物台采用诸如160×110 mm尺寸K接口的通用底座标准。另外,很多供应商均提供用于处理各种样品的载物台插件。

这种快速简便的解决方案可以用来观察多个培养皿或多个载玻片, 让您可以同时进行实验,因此可以节省大量时间。这种方法减少了用于更换标本和设置常规实验的时间,原因是对于多个标本而言大多数耗费时间的设置过程(如聚焦或优化图像采集参数)几乎相同。

当前随着机构继续要求实行社交间隔并限制出入实验室,在实验室中停留时间更短的优势也愈发明显。

显微镜标本夹上的多个标本

图1.通过用在显微镜载物台上放三个培养皿取代放置一个培养皿,您可以缩短用于实验准备和设置优化的时间,继而缩短了在实验室停留的时间

2.加快速度。

接下来就是优化图像采集速度。因为通常拖慢图像采集速度的瓶颈是滤色片或荧光镜组的机械切换过程,所以以下思路值得一试:

  • 优化图像采集顺序:如果采集Z序列图像时的Z轴移动速度快于荧光滤色片的更换速度,则应现在一个荧光通道采集Z序列图像后,再转到下一荧光通道的方式进行(图2,中间)。
  • 结合使用多通滤色镜组和LED光源:最新显微镜技术无需权衡取舍就能够实现某些改进。LED光源和多通滤色片组合就是其中之一。尽管每个通道的单通专用滤色片通常是防止荧光串色的理想解决方案,但最新LED光源足够锐利的光谱可以避免串色并具备快速波长切换功能。这可以让 您利用多通滤色片的优势缩短图像采集时间。使用多通滤色片的一个技巧是,尽可能使用波长更长并且更亮的染料。原因是从较短波长(能量较高)到较长波长(能量较低)会发生串色。
    显微镜成像

    图2.显示每个序列需要多长时间的图像采集序列变化。(上)Ch> Z序列,(中)Z> 通道序列,可以通过减少切换通道的机械运动节省时间;(下)Ch> Z序列,通道切换不存在机械运动。

  • 减少Z序列的数量:另一个考虑因素是减少Z采集的时间。如果您拥有足够可靠的自动对焦设备,那么无需采集太多的Z位置,并且可以缩短图像采集时间,从而将激发光的光毒性降至最低。

3.在工作效率和图像质量之间取得平衡。

通常情况下您应该想要采集最佳质量的图像。毕竟,图像是数据的主要来源,因此图像质量决定了下游分析的质量。但值得思考的是,为了加快实验速度需要达到的图像质量水平。有两个方面需要思考:

  • 速度与质量:图像质量的主要取舍因素是视场(FOV)和图像采集时间。当我们不使用视场外围区域时,就可以获得更平坦、更均匀的图像。然而,这会导致在相同区域采集更多数量的图像,因此需要更长的采集时间。该策略可以实现无缝拼接或精确定量分析,并且受外围区域的图像不均匀性影响最小。但是,如果您不需要 完美的无缝拼接图像,并且能够获得足够的分辨率,那么可以考虑使用更宽的视场或更低的倍率。无法同时牺牲速度和质量吗?然后使用可在整个视场获得超平坦、均匀图像的最新高性能物镜
    显微镜视场

    图3.(上)光轴和视场周边区域的光强度是影响图像质量的一项因素。当我们观察到较大视场时,阴影会更加严重。(左下)以较大视场进行拼接意味着需要的图像采集时间较短,但是图像接缝可能会很明显。在可以接受较低图像质量的情况下,这一策略可以加快您的实验速度。(右下)如果需要无缝拼接图像,则需要使用较小的视场。

  • 培养皿类型:尽管玻璃底的培养皿或多孔板对于图像质量而言最佳,但是聚苯乙烯多孔板不但可以节省成本还具有更好的细胞粘附性。以下为选择非玻璃底培养容器的技巧:
    • 注意,培养容器类型会影响图像质量和工作距离(WD)。使用较厚的培养容器(如塑料多孔板)进行成像时,通常需要更长的工作距离。相比玻璃底培养容器0.17毫米的厚度,大多数塑料培养容器的厚度为0.5到1毫米。确保使用具备足够长工作距离的物镜配合较厚的培养容器。
    • 确认系统与塑料培养容器的兼容性。比如,由于塑料极性的原因,微分干涉差(DIC)不能使用塑料培养容器。
    • 塑料培养容器具有一定程度的自发荧光。较低的自发荧光程度不会造成过多的背景光,而较高的自发荧光程度可以掩盖标本的荧光。在选择实验使用的培养容器之前,务必要检查自发荧光的影响,尤其是在使用紫外线或蓝光激发的情况下。

4.检查数据一致性和参考点。

在对很多样品进行实验时,数据一致性和参考点是数据可靠性和可重复性的关键。为了实现这一目的:

  • 使用稳定的细胞系
  • 避免多孔板外围的环境一致性(尤其是温度)与中心区域存在差异
  • 始终设有阳性和阴性对照标本
  • 检查环境稳定性,尤其是室温

5.利用隔夜机会。

某些电动和自动化的系统(如高内涵筛选系统全载玻片成像扫描仪)具有图像采集的批处理功能。批处理还可与分析软件一起使用。如果您拥有大量需要过夜处理的标本或数据,那么值得一试。设备可以在您休息的时候继续进行实验。

由于实验室每天均会调整政策以确保员工的安全和健康,因此务必注意,通宵进行实验可能会带来意外封锁或机构政策突然变动的风险。务必记住,在继续之前需要与您的主管确认是否可以进行通宵实验。

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高级产品和策略规划师和产品经理

Takeo Ogama是美洲奥林巴斯公司的高级产品和战略规划师,也是显微镜相机的产品经理。他在相机等各种产品的研发部门拥有八年的工作经验,并且在产品规划、营销和管理方面也拥有八年的经验。他拥有日本大阪大学中微子物理学硕士学位。

2020年9月30日
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