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博客文章

获奖科学家Hana Polasek-Sedlackova博士揭示scanR系统在解决DNA悖论中的作用

作者  -
DNA研究人员Hana Polasek-Sedlackova博士,摄影:Jana Mensatorova。

细胞分裂是所有生物体的基本过程。 在每次分裂之前,必须准确复制存储在DNA中的细胞遗传信息。 这种复制过程被称为DNA复制,其适当的调节对个体的健康和生存起着至关重要的作用。 了解细胞如何调节DNA复制以实现高度准确的基因组复制是生物医学研究的基本问题之一。 DNA复制过程中产生的错误会导致基因组不稳定,这与癌症等严重的人类健康疾病相关。 事实上,据先前的研究估计,多达三分之二的癌症是由DNA复制过程中的错误累积造成的。

认识DNA复制领域的开拓者

细胞如何复制其DNA也是Hana Polasek-Sedlackova博士的研究重点。 Hana在中学期间参加了马萨里克大学的科研实习,从而早早地接触到了实验室和DNA研究。 从那时起,她就成为了这一领域一颗冉冉升起的新星。Hana的本科毕业论文获得了著名的全球生命科学本科生奖,该奖项通常被称为“小诺贝尔奖”。 毕业后,她获得了诺和诺德基金会的奖学金,开始参加哥本哈根生物科学博士课程的学习。 凭借这笔奖学金,Hana进入哥本哈根大学诺和诺德基金会蛋白质研究中心的Jiri Lukas教授实验室攻读博士学位,并在那里继续接受博士后培训。 她的研究成果发表在《科学》和《自然》等权威科学杂志上。 最近,她在捷克共和国布尔诺的捷克科学院生物物理研究所(IBP)成立了自己的独立研究小组。

她的一项科学贡献就是解决了自上世纪90年代以来该领域科学家一直争论不休的MCM悖论。 该悖论描述了在使用显微镜和其他科学方法来阐明复制过程中的事件时,所观察到的结果似乎相互矛盾。 借助我们的scanR高含量筛查工作站,这一矛盾现已成功解决,而Hana正是该筛查工作站的忠实用户。 我们在布拉格分子遗传学研究所的一次scanR用户会议上见到了Hana,并借此机会向她询问了使用该系统的经验以及该系统对她的研究有何影响。

我们对Hana Polasek-Sedlackova的采访

Evident:当您在IBP成立自己的研究小组时,您为小组购置的第一台显微镜就是scanR高含量筛查工作站。 是什么让您选择了这套系统?

Hana Polasek-Sedlackova:在我的职业经历中,我有机会使用过几种显微镜。 根据我的观察,我很快意识到在选择显微镜时,应该考虑三个重要参数。 这些参数是硬件、软件和客户服务。 在仔细考虑了这些标准之后,我发现scanR是出色的高含量筛查系统。

首先,scanR的硬件系统简单明了,适应性强,可以根据用户的具体实验要求进行定制。 该系统具有从宽视场到超分辨率的多种成像能力、先进的荧光显微镜技术以及活细胞成像功能等。

其次,scanR具有直观且对用户友好的采集和分析平台,使用户能够在短时间内获得大量高质量数据。 通过对获取的成像数据进行实时多参数分析,可以立即检查数据并进一步优化采集参数,包括有用的重新扫描功能。 (重新扫描功能以较低分辨率对样品进行快速扫描,从而确定感兴趣的对象,然后以较高分辨率重新扫描。)

第三,Evident能够提供卓越的客户服务。 他们的显微镜维护和分析支持应用专家都是精湛的专业人士,会随时准备帮助用户解决他们的需求、愿望或问题。 多亏了捷克科学基金会和我们研究所的内部资金,我们才能购买并将scanR技术带到我的新研究所。

人类细胞示意图,聚焦于单个复制叉—DNA复制的基本单位。

通过scanR系统测量DNA复制动态。 (A) 人类细胞示意图,聚焦于单个复制叉—DNA复制的基本单位。特定的荧光探针可用于研究MCM与DNA的结合(Halo)、活性CMG螺旋酶组装(GFP)和DNA合成(EdU)。 (B) 基于scanR的人骨肉瘤U2OS细胞DNA复制关键事件的多参数分析。 (C) 图像库展示了DNA复制蛋白在整个细胞周期中的动态变化。

Evident: scanR系统如何推动了您的研究? 您能否举例说明scanR系统在哪些方面帮助您获得了新的见解?

Hana: scanR系统帮助我们在DNA复制领域取得了重大发现。 在我的研究中,该系统在解决MCM悖论—一个有关MCM2-7蛋白复合物行为的挥之不去的谜题—中发挥了重要作用。 MCM复合物是复制螺旋酶的核心,负责解开双螺旋DNA以确保准确复制。 多年来,研究人员一直对两个广泛报道的悖论事实感到困惑: (1) 如果只有5-10%的细胞用作活性复制螺旋酶,那为什么细胞会携带大量过剩的非活性MCM? (2) 为什么从未使用显微镜方法在细胞内的复制位点观察到真核生物的MCM?

我们最近重新审视了这一长期存在的概念性僵局,并对MCM悖论进行了澄清。 利用CRISPR-Cas9基因组编辑和scanR高含量成像技术,我们阐明了活细胞DNA复制叉成像中长期存在的难题,并揭示了保护基因组完整性所必需的DNA复制起源的新平衡途径。1-2 

我们发现,过量的非活性MCM可充当天然复制暂停位点(NRPS),调整复制叉速度,从而最大限度地减少DNA复制过程中的错误。 凭借这一特点,NRPS代表了另一种经常被癌细胞利用的复制叉速度控制,使其成为癌症治疗的一个新的有吸引力的靶点。 目前,我的研究团队正在探索DNA复制起源的顶端调控途径及其对人体组织发育的病理生理状态的贡献。

利用scanR发现MCM复合物的蛋白质变体,揭示了MCM悖论。

利用scanR发现MCM复合物的蛋白质变体,揭示了MCM悖论。(A) 用于区分MCM蛋白库的HaloTag标记方案。基于scanR的高含量分析揭示了亲代和新生MCM蛋白复合物在DNA复制过程中的不同动态。 (B)描述亲代和新生MCM在DNA复制过程中不同功能的模型。 亲代MCM主要转化为活性CMG螺旋酶,而新生MCM在很大程度上仍处于非活性状态,但其功能是作为天然的复制体暂停位点,对设置复制叉的正常移动非常重要。

Evident: 您在哪些应用中使用scanR系统?对哪一类样品进行了成像?

Hana: 在我们的研究中,我们使用各种组织培养模型,其中大部分来自人体样本。 这些样本包括来自骨骼、乳腺、卵巢、宫颈或肾脏等不同组织的癌细胞系,以及非癌细胞系、干细胞和成纤维细胞。 有时,我们也会在研究中使用动物样本。 我们将这些样本与各种细胞生物学、生物化学和遗传学方法结合使用,以确定在无差错基因组复制中发挥重要作用的新蛋白质或整个调控途径。 此外,我们还研究这些新蛋白质或途径在癌细胞中的调控方式,以及它们是否在肿瘤生成中过程中赋予癌细胞优势。如果我们发现确实如此,那我们就可以利用我们的知识开发出新方法来治疗癌症。

我们鉴定DNA复制中的新蛋白因子的典型实验流程涉及对大量单细胞群进行剖析,而scanR系统在这方面提供了巨大帮助。 例如,如果我们发现了一种新的候选蛋白质,那我们首先会使用各种方法在细胞中对其进行下调。 然后,利用高含量成像技术,逐步监测DNA复制的准确性。 在实验中使用细胞的好处是,我们可以在其自然环境中观察基因组的复制过程,但其复杂性也会给数据解读带来挑战。

因此,在研究DNA复制的同时,我们还需要仔细研究相关基因的消耗对其他细胞过程的影响,例如细胞周期、DNA损伤反应、转录、染色质维护、特定染色体区域的维护、整体基因组稳定性等。 这种在极短的时间内获得的大量单细胞群的无偏性和定量图谱为我们快速解读数据带来了极大地帮助,进而高效地推进我们的研究。

利用AI深度学习技术对小鼠成体大脑中的单个细胞进行图像分析

利用TruAI深度学习模块对成年小鼠大脑中的单个细胞进行图像分析。大脑样品由Jana Krejci博士(生物物理研究所细胞生物学表观遗传学系)准备。

我曾经花了几个小时在显微镜前手动获取图像,之后又花了更多时间在电脑前分析图像。 这些实验需要几个月才能完成。 现在,有了scanR,一切工作都可以在几个小时内完成。

Evident: 这些应用如何受益于该系统的高含量分析能力和基于图像的细胞测量方法?

Hana: 在细胞生物学领域,我认为将无偏性定量信息与图像相结合是一种可靠而精确的方法,可用于表示重要的细胞过程。 ScanR系统为此提供了一个简洁而智能的解决方案。 正如我之前提到的,scanR系统可全自动采集和分析样品,使我们能够获得有关细胞过程的无偏性信息。 重要的是,只需点击一下,就能直接检查数据背后的图像。

此外,还可以创建无偏性图像库,说明相关蛋白质在整个细胞生命周期中的动态变化。 得益于这种独特的图像-数据耦合,可以进一步将细胞过程的分析细化到特定区室,例如细胞核或细胞质,以及DNA修复灶等亚核区室。 这种定量数据的可视化补充有助于更有效地解决生物学问题。

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正在进行的通过结合scanR和cellSens系统自动获取和分析DNA纤维的工作示例。 (A) 用于观察单个复制叉的CldU-IdU标记方案。 (B) 通过scanR系统和cellSens软件自动采集和分割DNA纤维的示例。

Evident: 该系统是否改变了您将显微镜作为细胞生物学和分子生物学工具的方法? 您是否使用该系统的TruAI深度学习功能?

Hana: 我在Jiri Lukas教授的实验室攻读博士学位期间,接触到了高含量成像和scanR系统。 这项革命性的技术彻底改变了我对细胞生物学和一般研究的看法。 这项技术能够对细胞过程进行无偏性的全自动分析,给我留下了特别深刻的印象。 鉴于当前科学研究中存在的可重现性危机,我坚信研究人员应寻求能够以全自动方式获取和分析数据的工具,从而呈现细胞过程的无偏性表述。

在当前的人工智能(AI)时代,图像分析已经超越了以往的局限性。 scanR系统现在提供了TruAI深度学习模块,而这扩大了我的研究范围。 以前,我主要侧重于分析大量培养人类细胞系中的单细胞。 然而,有了AI模块,我们可以对器官切片中的单个细胞进行极其精确的图像分析。

我们如何突破图像分析功能极限的另一个例子是将scanR和cellSens系统结合使用。 这使我们能够对单分子进行全自动采集和分析,例如通过DNA纤维技术制备的DNA复制叉。 以上是我的实验室目前正在研究的一些新应用示例,我们希望其他研究人员也能很快从这些工具受益,在细胞生物学领域取得重大发现。

Evident: 您最喜欢scanR系统的哪一点? 您的研究伙伴们的评价如何?

Hana: 我很欣赏ScanR系统的许多功能,但如果只强调其中一个,那就是自动采集和分析之间的独特联系,这使我们能够实时对采集的图像进行多参数分析。 当我还是一名博士生时,这项功能就给我留下了深刻的印象,我们研究所的scanR用户小团体中的每一位新用户也同样对这项功能印象深刻。

我的一位同事总结道:“我过去常常在显微镜前花几个小时手动获取图像,之后又花更多时间在电脑前分析图像。 这些实验需要几个月才能完成。 现在,有了scanR,一切工作都可以在几个小时内完成。”

有关scanR系统的更多信息

我们衷心感谢Hana Polasek-Sedlackova博士与我们分享了她使用scanR高含量筛查工作站的经验。 有关scanR系统和我们其他生命科学研究解决方案的更多信息,请直接联系Evident或您当地的Evident销售代表。

Hana Polasek-Sedlackova博士的照片 由Jana Mensatorova拍摄。

参考文献

  1. Polasek-Sedlackova H, Miller TCR, Krejci J, Rask MB, Lukas J. Solving the MCM paradox by visualizing the scaffold of CMG helicase at active replisomes. Nat Commun. 2022 Oct 14;13(1):6090. doi: 10.1038/s41467-022-33887-5. PMID:36241664;PMCID:PMC9568601.https://www.nature.com/articles/s41467-022-33887-5
  2. Sedlackova, H.,Rask, M.-B.,Gupta, R.,Choudhary, C.,Somyajit, K.,Lukas, J.(2020, October 21). Equilibrium between nascent and parental MCM proteins protects replicating genomes.Nature News.https://www.nature.com/articles/s41586-020-2842-3

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Application Specialist, Evident Technology Center Europe GmbH (ETCE), Germany

After obtaining his master's degree in biochemistry with a strong emphasis on molecular biology in Hannover, Timo moved to Göttingen to pursue a doctorate in the field of microscopy. At the Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, he worked on new designs for switchable fluorescent proteins and their application in super resolution microscopy methods. Following the completion of his doctorate in 2019 and a brief postdoc, he joined Evident as an application specialist for our cellSens™ software, scanR high-content screening station, and TruAI™ deep learning technology at ETCE in Münster, supporting customers worldwide.

2024年5月2日
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