用于共焦显微镜的激光系统

激光扫描共焦显微镜常用的激光是高强度单色光源，可用作多种技术的工具，包括光学捕获、寿命成像研究、光漂白恢复和全内反射荧光（TIRF）。此外，激光还是扫描共焦荧光显微镜的常见光源，尽管在常规的宽视野荧光研究中使用频率较低，尽管已被使用。

激光会发出强烈的单色光，这些光束是相干的，这意味着激光在空间和时间上是同相的，并且可以被准直或缩小，从而形成了非常低的扩展率的紧密光束。与其他光源相比，激光器发出的非常单纯的波长范围具有带宽和相位关系，这是钨卤素灯、弧光放电灯或LED光源无法比拟的。因此，激光束可以长距离传播，并且可以扩展以填充孔径光阑，或聚焦到非常小的高亮度光斑。除了所有激光器（包括增益介质（光源），激发源（电源）和电子谐振器）的共同点之外，这些光源在尺寸、成本、输出功率、光束质量、功耗和使用寿命方面也有根本不同。

大多数激光系统产生的单色光的相干性，导致这些光源用于经典宽视野显微镜的应用出现问题。光路中的每个表面上的干涉会导致光散射和衍射图案。此外，视场光阑和孔径光阑以及灰尘也会产生伪像。这些不良影响可以通过多种技术来最小化或消除。常见的方法包括通过快速改变光源和显微镜之间的光路长度来暂时引入扰频激光，或者像共聚焦显微镜系统一样逐点扫描标本。此外，孔径扫描技术通常可以消除干扰和其他伪影。如果激光束的路径长度或相干状态以比检测器检测时间（实际上是视频帧速率）更快的间隔波动，则斑点和散射伪影将从图像中消失。

一些研究人员采用了一项成功的技术来改善氩离子激光光源产生的微分干涉（DIC）图像，即在光路上放置一个以每分钟2500转的速度旋转的圆形玻璃楔块。当楔块在扩展的激光束前面旋转时，楔块厚度的差异会引起光程长度的快速变化。当前，通常通过采用光纤光导管在光源和显微镜之间传递光来实现路径长度变化。振动光纤会在光程长度上产生连续变化，从而导致光束在低于振动级别的频率上暂时变得不相干。振动可能由压电设备，扬声器或激光头中使用的冷却风扇产生。

图1所示为自锁模Ti：蓝宝石脉冲激光器，目前是大多数多光子荧光显微镜研究中首选的激光激发源之一。Ti：蓝宝石锁模激光器提供了从690nm到超过1050nm的大波长调谐范围，脉冲宽度的长度约为100飞秒。此外，这些激光器具有足够的功率（在整个调谐范围内大于100毫瓦），足以使大多数荧光团中的双光子激发饱和。为确保对激光晶体进行适当的冷却和湿度控制，将氮气泵入密封的激光头中，并通过外部冷却器将其保持在恒定温度下。

许多激光系统产生的光是线性偏振的，偏振矢量垂直定向。可在需要偏振照明源的应用中利用此属性，例如微分干涉成像，偏振光测量或荧光偏振各向异性的定量研究。

激光束的相干性和偏振特性是通过光束横截面或轮廓中的光分布来衡量的，该分布随距激光出射镜的距离的增加而变化。以下对激光束特性的讨论作为本主题的概述，可以证明在显微镜成像，激光陷波和其他应用中使用激光很有用。

当激光器以简单的横向电磁模式（称为TEM（00）模式）工作时，发出的光束具有平面波前和高斯强度（辐照度）轮廓。通常将激光束直径定义为强度降至其峰值的e（E-2）（13.5%）时的值。激光束的高斯分布是由于衍射而产生的，它阻止了完全准直的光束的传播并引起光波的横向扩展。靠近激光输出孔（称为近场），光束的相位前缘会变得混乱。因此，光束横截面的形状、大小和辐照度随距激光的距离迅速变化。在更大的距离（远场），相前锋稳定为合成的高斯分布。在一些文献参考中，近场和远场分别由菲涅耳带和弗劳恩霍夫带的替代术语来指代。近场有时也称为瑞利范围。远场始于距离z，定义为

z = A⁰₂/λ

其中A（0）是出射孔的光束直径，而λ是激光器发出的光的波长。将这个方程应用于发射波长为488nm的0.6毫米束腰直径光束的氩激光器，在距出射孔约74厘米以外为远场。

图2所示为近场和远场中激光束几何形状和发散的示意图。如上所述，可以将光束实质上视为平行的波阵面束，其在近场中几乎没有扩展。近场以外，从光束中心到边缘（e（E-2））测得的光束发散角（φ）变得更大，并成为确定光束直径（D）关键参数。等式：

光束直径（D）= 2L • tan(θ)

其中D是表示激光束直径的变量，L表示从激光出射孔到光束测量点的距离的长度。实际上，在许多显微镜应用中，包括辐照度分布图在内的几种激光束特性是至关重要的因素，在配置成像系统时可能需要了解到远场的距离。表1列出了许多常用激光器和发射线的该距离的计算值（使用上述方程式）以及典型的束腰直径。

到远场的距离

表1

在大多数激光应用中，光束是否表现出高斯特性很重要，因为光束通常必须通过透镜和其他光学组件进行聚焦、变形和其他处理。高斯光束具有某些可定义的变换特性，这些特性使得可以对光束如何在光学系统中传播进行设想。

高斯光束在远场中的角半径（或光束发散角；见图2），由θ（以弧度表示）表示为：

θ = λ /Ï€a₀

其中a（0）是激光出口孔径处的束腰半径。束腰直径是激光波长、腔长度和腔的其他设计参数的函数。随着距激光的距离（z）的增加，束腰半径由以下公式给出：

a(z) = θ_z

通常，激光束的特征在于光束传播参数，例如M或K的平方（等于M的平方的倒数），由近场和远场测量的组合确定，如下所示：

M²= Ï€A₀θ/4λ

M2的较小值（称为传播常数或传播因子）表示较高的光束质量，尤其是在较小的直径和发散度方面。该因子描述了实际光束与理想高斯光束的关系。

相干高斯光束具有特定的特性，这些特性使它们与非相干光束在通过透镜和反射镜的传播和转换方面有所不同。如果是衍射极限光束，则高斯光束的强度分布本身就是高斯，前提是光束不会被镜头光圈截断。当高斯光束直径为透镜孔径的一半时，出射光束的强度分布仍为高斯。当高斯光束直径等于透镜孔径的直径时，输出光束强度曲线是高斯函数和艾里斑强度的混合。最后，高斯光束直径明显大于透镜孔径的直径，从而产生艾里斑的输出剖面。在后一种情况下，由于透镜入口孔径的溢出，可能会损失大部分激光功率。

高斯光束光学的基本理论已在许多教科书中全面介绍，此处未讨论的细节可以从更全面的资源中获得。高倍光束的两种操纵方式对显微镜专家来说特别有趣，即光束集中和光束扩展。

当通过无像差显微镜物镜将激光束聚焦到非常小的光斑（光束密度）时，聚焦处（距离z处）的光斑半径由以下表达式给出：

a(z) = λf/Ï€a₀

其中f是镜头的焦距。其中f是镜头的焦距。例如，如果使用数值孔径为1.3的100x物镜（产生约1.6毫米的焦距）来聚集半径为0.3毫米的氩激光器的488nm光束，则聚焦点半径（确定为根据前面的方程式）为0.8微米。通过光束扩展将光束腰部增加五倍（如下所述），将导致聚焦点半径约为0.16微米。

重要的是要注意，在聚焦激光束的焦点处实现了极高的功率密度。聚焦到直径为0.22微米的衍射极限点的10兆瓦光束产生的功率密度约为每平方厘米3000万瓦。如此高的能量水平会迅速降解或破坏镜片和滤光片涂层，并对生物标本造成相当大的光化学损伤。然而，对于如此微小的斑点，热能在水中的扩散会非常有效，以至于高能量的近红外光束对生物标本的损害很小，除非样品对能量的吸收足够高。

在光学显微镜中激光器的许多应用中，最初是通过使用Keplerian或Galilean光束扩展器来扩展激光束，而这两种扩展器实际上都是倒置显微镜（典型的激光光束扩展器的解剖特征如图3所示）。如果首先扩展激光束，则可以减小相干高斯光束的发散，并且可以在更长的距离上更好地准直光束。参考前面的等式，在激光出射孔处，光束的角半径θ与光束腰部半径a(0)成反比。因此，扩大束腰半径会成比例地减小发散。

对于显微镜中的许多应用来说，将激光输出通过柔性光纤直接输送到显微镜光路中是很可行的（如图4所示）。此技术优于刚性对准激光器和显微镜，该方法要求使用庞大的无振动光学平台以及众多固定镜和其他组件

当激光束通过透镜聚焦到光纤上时，从光纤射出的光束的耦合效率和特性在很大程度上取决于光纤的几何形状。用于激光传输的大多数光纤均由熔融石英纤芯构成。这些纤维的内芯由高折射率二氧化硅制成，并被称为包层的套管包围，该套管由较低折射率的材料组成。通过在纤芯和包层的界面处进行全内反射，可以防止光沿着光纤的长度方向逃逸。包层可以由二氧化硅，玻璃，硬质氟聚合物或软质硅树脂组成。

光纤根据其内芯的直径分为单模或多模。单模光纤仅允许在一个特定波长传播最低阶模（图4）。波的传播波长和偏振的维持由纤维直径决定。尽管其他波长可能会传播，但它们的传播效率会降低。对于可见光波长，典型的单模光纤直径范围为3到6微米，单模光纤的输出辐照度曲线为高斯分布。

多模光纤能够传播一种以上的模式，并且不限于单个波长。多模光纤的内芯比单模光纤的内芯大，直径范围从大约100微米到1.2毫米。来自多模光纤的输出辐射方向剖面具有扁平形状（称为礼帽轮廓，其数值孔径由纤芯和包层折射率确定。

光纤纤芯的接收锥角θ与光纤的数值孔径NA有关，如下所示：

NA = sin θ/(n²纤芯 - n²包层)^1/2

其中n代表折射率。当纤芯的数值孔径和聚束透镜的数值孔径匹配时，激光就可以有效地耦合到纤芯。通过光纤的光传输效率通常高达约90%，但可能会因半径很小（小于3厘米）的弯曲而急剧降低（仅为60%或70%）。

在利用任何激光时，至关重要的是，不仅要防止任何直接或镜面反射的激光进入观察者的眼睛，而且要避免光束从光学系统的组件反射回激光系统。前者是明显的人身安全预防措施，而后者则对于防止附加的反射器将相干光束返回到激光器中，从而可能对系统造成损害非常重要。

激光光源的稳定性是许多应用中的重要方面，尤其是在定量显微成像中，在这种情况下，照明强度的波动会对实验结果产生不利影响。与激发和腔长波动相关的许多因素会在输出光束中引起频率噪声，但是其他引起幅度波动的扰动会同时产生高频强度噪声和光输出功率的缓慢变化（漂移）。这些强度波动的某些来源与激光头本身或电源的功能有关。下面列出了各种激光类别的输出光束中最常见的噪声源：

• 气体激光器 - 反射镜由于共振器振动、光学泵浦源产生的噪声、离子振荡过程的不稳定性和离子放电过程的不稳定性、电源电流的波动、冷却水湍流产生的微音以及强制风冷系统中的风扇引起的噪声而导致的镜面失调都是潜在的噪声源。
• 固态激光器 - 噪声源包括麦克风、灯和二极管泵浦的泵浦源波动、腔对准误差以及与激光介质中的热波动相关的随机频率相关噪声（称为1/f噪声）。
• 染料激光器 - 噪声（高频）和漂移都是由染料溶液中的密度不均匀性和气泡以及染料泵和激光泵源的不稳定性引起的。
• 半导体（二极管）激光器 - 噪声可能是由于驱动器（偏置）电流或温度的波动而引起的，1/f噪声是由接点处载体的捕获和其他类型的载流子（电子-空穴）复合效应引起的。

所有激光器都容易受到其电源引入的噪声的影响。交换由于其效率高和体积小而成为普遍的电源，特别有可能在数十kHz的频率范围内向激光系统引入纹波。当这种干扰影响光学显微镜系统中的光束时，尤其难以诊断和消除。主要的困难是由于与其他来源（例如实验室环境中的电磁场）引入系统的噪声相似。为了获得足够的输出稳定性，半导体激光器必须使用具有最高电稳定性和最低噪声的二极管电源以及准确的温度控制来工作。必须控制其他外部噪声源，包括实验室中的灰尘和来自当地交通和建筑设备的振动。

连续波光强（cw）激光器的光束强度可以通过电子控制管电流或通过利用调制光强度的外部组件来稳定。通常采用两种不同的方法来控制管驱动电流。在恒流模式下，电子管电流直接由电子反馈回路控制，以最大程度地减少波动。由于激光输出还取决于温度，因此，如果提供适当的温度控制，这种类型的控制电路最有效。恒定输出功率稳定系统通过响应来自使用分束器和光电二极管监视器对输出光束进行采样的电路的信号来控制驱动电流来进行操作。这种物理布置适用于气体激光器和其他几种类型，但是较小的二极管激光器通常组装在已经包含一个集成光电二极管的封装中。监控光电二极管对从激光晶片后表面发射的光进行采样，并产生一个信号，该信号能够对输出功率进行反馈控制。

用于提供稳定激光强度的外部组件通常采用快速反馈系统来控制电光调制器，从而将光束功率的波动降至最低。外部Pockels单元调制器（参见图5）可从许多制造商处获得，并且原则上可用于稳定任何连续波激光器的输出功率。可以通过此技术纠正较大的强度波动（最多约50%），但总输出功率将成比例降低。对于许多系统来说，长范围的校正能力很重要。例如，氦镉激光器的输出功率可能会发生大约20%的变化，部分原因是某些光束频率之间存在强烈的等离子体振荡。据报道存在适用于调节连续波和锁模的系统。激光的输出功率在其输出功率的百分之几以内，并且频率范围从直流到几百兆赫兹，且噪声衰减为500：1或更高。

Pockels单元调制器的基本组件如图5所示。用于调节激光输出强度的外部设备类似于图5所示的设计，有时被归类为或者以消声器的商品名在市场上出售。利用Pockels效应的电光调制器的基本概念是基于一种以极快的速度改变单元的偏振特性，以提供用于控制激光强度的可变光束衰减器。激光输出的偏振状态决定了调制器的总衰减，但最高可达80%的透射率。从激光头发射之后，光束的一部分被分束器转移到光电二极管，该光电二极管将强度与预设（可选）参考强度进行比较，并放大差信号，从而可以驱动电光普克尔斯盒调制器。放大后的信号在晶胞中产生折射率变化，使极平面旋转，从而与施加的电压差成比例地改变电子束衰减。在极化特性随电场变化而变化的物质中（普克尔斯效应），磷酸二氢钾和铌酸锂这些材料的晶体，通常用于光束调制器中。

在通过Pockels单元系统稳定了随机偏振光的情况下，调制器必须位于交叉偏振器之间，并且需要进一步考虑将这些附加组件对光束稳定性的影响降至最低。由于灰尘、振动和其他干扰会改变光路中任何一点的光束稳定性，因此在光学显微镜系统中，外部稳定器应尽可能靠近标本位置。这种努力将确保将最稳定的光束传送到标本。

二极管激光器是已经发展了数十年的半导体器件，现在已经可以提供足够的输出功率，这是显微镜学家感兴趣的。二极管激光器的波长范围从紫外到近红外，输出功率足以用于共焦显微镜应用。此外，现在可用的那些二极管激光器具有改善的光束形状和稳定性，从而使其在许多应用中可以替代气体激光器。二极管激光器的使用寿命通常在10,000到50,000小时之间，但对静电冲击极为敏感，因此必须小心操作。

光学显微镜学家非常感兴趣的是可调谐二极管激光器的开发，该二极管激光器现在可以在功率和多功能性方面与可调谐染料激光器和Ti：蓝宝石激光器竞争（在下面讨论并在图1中进行说明）。可调谐染料激光器的波长范围为600至1800nm，可提供5至25毫瓦的功率。它们具有成本相对较低、尺寸紧凑、寿命长和发热少的优点，从而消除了对外部冷却系统的需求。

二极管泵浦固态激光器（DPSS）利用二极管激光器代替稀有气体、弧光灯或闪光灯来泵浦固态激光材料。二极管泵浦激光器表现出的功率输出、光束质量和稳定性接近气体（氦氖）激光器，但效率和尺寸却与二极管激光器相当。二极管泵浦激光器的常规运行和维护成本低于气体激光器，并且大多数系统通过对流或强制空气进行冷却。

二极管泵浦钕钇铝石榴石（Nd:YAG）激光器可在毫瓦功率范围内产生1064nm的光。倍频导致具有532nm连续波输出的紧凑型设备，并且三倍频也可用于产生355nm的脉冲输出。开发了紧凑折叠谐振器（TFR），用于泵浦氟化钕钇锂锂晶体（Nd:YLF）使用二极管激光器阵列以高功率和高效率产生1047nm的数瓦功率。在这种类型的激光器中，倍频，三倍和四倍频导致在523、349和262nm（二次、三次和三次谐波）处输出高达数百毫瓦的相干光。二极管激光器作为泵浦源的其他优点包括：寿命延长（与灯泡的数百小时相比，通常超过5000小时），准直且易于聚焦的输出激光量比得上小激光发射量的固态激光器，并且减少了激光棒的热负荷，当使用卤素弧光灯作为泵时，通常需要水冷。

要求在绿色（532或523nm）和紫外线（355或349nm，以及266nm的四次谐波）波长范围中需要高功率（通常为几瓦）的工业和商业应用推动了二极管泵浦固态激光器的发展。紫外光谱区域的输出是脉冲的，能量范围从100微焦耳到10毫焦耳，脉冲持续时间在纳秒范围内，重复频率高达10 kHz。这些激光在显微镜下触发笼状化合物的释放非常有用。然而，脉冲重复率仍然太慢而不能用作大多数共聚焦显微镜应用的照明源。

进一步的发展导致将二极管泵浦固态激光器与光学参量振荡器（OPOs；见图8）相结合，以产生可调谐的脉冲输出，该输出可在205nm至2000nm之间连续变化。尽管最初可用的系统价格昂贵且操作复杂，但仍在引入更适合用于显微镜的小型系统。

掺钛蓝宝石激光器（通常称为Ti：蓝宝石激光器，请参见图1）具有脉冲和连续光传输可调性以及固态可靠性的优点。这些激光器可以以高重复频率（100MHz）发出非常短的光脉冲（大约80到100飞秒）。可调波长范围从远红色到近红外光谱区域（700到1000nm）。这些激光器中的大多数都通过高功率氩激光器在光泵浦下运行，并且需要水冷。由于操作和维护Ti：蓝宝石激光器所涉及的费用和复杂性，它们的使用主要限于多光子显微镜。

结论

多光子和共聚焦激光荧光显微镜之间的主要区别在于这些通常互补的技术中使用的激光类型。与共聚焦显微镜中使用的小型风冷激光器相比，用于多光子显微镜的激光器要昂贵得多且难以操作。

当前，激光在显微镜中的应用在共聚焦显微镜、光学捕获以及释放笼状化合物和荧光团的领域迅速扩展。在全光谱区域具有发射线的紧凑型固态激光器的发展有助于进一步提高这些设备在显微镜下的利用率。