Erweiterte Zeitrafferaufnahmen der Zellmotilität und -proliferation mit dem Olympus FLUOVIEW FV3000 und dem TruFocus Z-Drift Kompensationssystem

Aufnahmen von Zellkulturen bilden die Grundlage für die Untersuchung einer Vielzahl von biologischen Phänomenen. Mit dieser Technik lassen sich die Zellproliferation und -dynamik im Zeitverlauf nachverfolgen. Da Zellpopulationen lokal unterschiedliche Proteinexpressionsprofile und Motilitätsmuster aufweisen können, muss bei bildgebenden Verfahren sorgfältig darauf geachtet werden, eine Beeinflussung des Ergebnisses durch Mängel bei der Auswahl des untersuchten Bereichs bzw. der untersuchten Probe zu vermeiden. Daher sollten zellkulturbasierte Bildgebungsexperimente so konzipiert sein, dass mehrere Sehfelder über die Mikroplattenvertiefung oder das Kulturgefäß hinweg möglich sind. In diesem Anwendungsbeispiel untersuchen wir, wie mit dem Mikroskop FV3000 Zeitrafferaufnahmen über mehrere Flächen mit komplexen Aufnahmeparametern durchgeführt werden, um vollständige und robuste Datensätze aus einem einzigen Experiment zu erhalten.

Aufzeichnung mehrerer Sehfelder in einem einzigen Experiment

In diesem Experiment wurde das Multi-Area-Time-Lapse-Modul (MATL) des konfokalen Mikroskops FV3000 verwendet, um die Motilität und Proliferation humaner Nabelvenenendothelzellen (HUVEC), die grün fluoreszierendes Protein (GFP) im Zytosol exprimieren, über einen Zeitraum von ca. 12,5 Stunden kontinuierlich zu überwachen. Bei der Planung des Experiments war es wichtig, mehrere Regionen mit verschiedenen Vergrößerungen und Z-Stapel-Parametern zu beobachten, um die Dynamik einzelner Zellen und der Population als Ganzes zu verfolgen. Da das MATL-Modul die Registrierung unabhängiger XYZT-Parameter für jede Position oder jeden gekachelten Bereich erlaubt, war es einfach, verschiedene Bildgebungsbedingungen für mehrere Regionen mit unterschiedlichen Vergrößerungen und Z-Stapel-Parametern im Zeitverlauf zu programmieren.

_{Abb. 1: Schema einer Multi-Area-Time-Lapse-Aufnahme. Für jede Vertiefung in der Well-Platte wurden mehrere Positionen von einzelnen und gekachelten Bereichen mit verschiedenen unabhängigen Vergrößerungs- und Z-Stapel-Parametern programmiert. Diese registrierten Positionen wurden in einem Zyklus von 12 Stunden und 25 Minuten abgebildet.}

Positionsspezifischer Autofokus zur Verfolgung der Motilität und Proliferation von HUVEC-Zellen

Eine der größten Herausforderungen bei der Abbildung mehrerer Bereiche im Zeitverlauf ist die tendenzielle Verschiebung des Fokus aufgrund kleiner Temperaturschwankungen im Mikroskopierraum. Außerdem kann der Abstand zwischen der Deckglasoberfläche und dem Probengewebe auf der Fläche variieren, was es noch schwieriger macht, klare Bilder über mehrere Sehfelder zu erhalten. Das TruFocus Z-Drift Kompensationssystem löst diese Probleme mithilfe eines nichtphototoxischen Nahinfrarotlasers, um die Kontaktstelle zwischen Deckglas und Probe zu lokalisieren und die entsprechende Fokusposition zu bestimmen. Durch die Kombination des TruFocus Systems mit der MATL-Funktion ist es einfach, mehrere unabhängige XYZT-Positionen mit positionsspezifischem Autofokus zu registrieren.

Im Verlauf dieses Experiments wurden mehrere Regionen mit unterschiedlichen Vergrößerungen und Z-Stapel-Parametern zyklisch gemessen, um Veränderungen in der Motilität und Proliferation der HUVEC-Zellen zu verfolgen, sowohl auf der Ebene einzelner Zellen als auch auf der Ebene der gesamten Population. Wie in den Video-Highlights in Abbildung 2 zu sehen ist, ermöglichte die Kombination von MATL mit dem TruFocus System die wiederholte Abbildung mehrerer Wells bei gleichbleibender Schärfe während des 12-stündigen Experiments.

_{Abb. 2: XYZT-Multi-Area-Time-Lapse-Aufnahme von HUVEC-Zellen, die GFP im Zytosol exprimieren. Abgebildet sind 4 Beispielbilder von verschiedenen Positionen mit unterschiedlichen Aufnahmeparametern. Das TruFocus System wurde eingesetzt, um die Probe während des 13-stündigen Experiments in den verschiedenen Sehfeldern im Fokus zu halten.}

Bildgebungsbedingungen

Die beiden oberen Bilder:
Objektiv UPLXAPO20X
Mikroskop: Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop FLUOVIEW FV3000RS
Laser: 488 nm (GFP, grün)
Scanner: Resonanz
Z-Serie: 16 Stufen
Gesamtzahl der gescannten Bereiche: 14

Die unteren beiden Bilder:
Objektiv UPLXAPO10X
Mikroskop: Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop FLUOVIEW FV3000RS
Laser: 488 nm (GFP, grün)
Scanner: Resonanz
Z-Serie: 15 Stufen
Gesamtzahl der gescannten Bereiche: 48

Gesamtdauer des Experiments: 13 Stunden und 11 Minuten.

Vorteile des konfokalen Mikroskops FV3000 für unsere Untersuchung

Beibehaltung des Fokus bei Multi-Area Time-Lapse-Aufnahmen mit dem TruFocus Z-Drift Kompensationssystem von Olympus

Das TruFocus Z-Drift Kompensationssystem (ZDC) ist ein vollständig motorisiertes Modul, das die Fokusdrift ausgleicht, um die Probe bei Langzeit-Zeitrafferexperimenten im Fokus zu halten. Das TruFocus System erweitert die Anwendungsmöglichkeiten, da es eine große Anzahl von Objektiven und Gefäßtypen unterstützt, beispielsweise sowohl Schalen mit Glas- und als auch solche mit Kunststoffböden. So lassen sich klare, fokussierte und kontinuierliche Zeitrafferdaten unter verschiedenen Bildgebungsbedingungen ohne Probleme mit der Z-Drift erzeugen.

Unabhängige XYZT-Parameter mit dem Multi-Area Time-Lapse (MATL)-Software-Modul Das Multi-Area Time-Lapse (MATL)-Softwaremodul steuert den motorisierten XY-Tisch des FV3000 Mikroskops und ermöglicht unabhängige XYZT-Parameter für jede registrierte Position oder jeden gekachelten Bereich. Das MATL-Modul liefert robuste und genaue Zeitrafferdaten durch vollständige Hardware-Integration und das präzise Timing des inversen Mikroskops FV3000. Aus diesem Grund eignet sich das System gut für die Aufnahme zahlreicher handelsüblicher Kulturgefäße mit Deckglas oder sogar kundenspezifischer Vorrichtungen und Mikrotiterplatten.

Kommentar von Dr. James Hoying Wir arbeiten mit einer Vielzahl von vaskularisierten 3D-Gewebemodellen in Multiwell-Platten. Das TruFocus System und die MATL-Funktionen des FV3000 Mikroskops sind von unschätzbarem Wert, da wir oft Messungen der Vaskularität und der Gefäßmorphologie in Dutzenden von Geweben gleichzeitig durchführen müssen, für die wir hochauflösende konfokale Bilder der 3D-Gefäße verwenden.

Danksagungen

Dieser Anwendungshinweis wurde mit der Hilfe folgender Forscher erstellt:

Dr. James Hoying, Chief Scientist, Advanced Solutions Life Sciences