Von Robert Hookes erster Beobachtung würfelförmig geteilter Zellen unter seinem selbstgebauten Mikroskop über Osamu Shimomuras Erforschung von Quallen-Aequorin und GFP bis zu Xiaowei Zhuangs neuartigen blinkenden Farbstoffmolekülen bei der superauflösenden 3D-Rekonstruktion – die Erforschung der Mikrokosmen des Lebens entwickelte sich dank der optischen Mikroskopie immer weiter.
Als tragende Säule der vierten industriellen Revolution erlebte die Nanotechnologie im 21. Jahrhundert eine Blütezeit, zunächst im Bereich der materialwissenschaftlichen Anwendungen. An der Schnittstelle zwischen Nanotechnologie und Biowissenschaften entstand eine neue Innovation – fluoreszierende Nanosonden, die den Mikrokosmos des Lebens durch Nanomaterialien zum Leuchten bringen.
Anfänge der Fluoreszenzmikroskopie
Fluoreszenz ist eine Form der Photolumineszenz und wird durch die Absorption von Licht verursacht. In der Natur gibt es zahlreiche Fluoreszenzphänomene. Das aus Leuchtquallen gewonnene grün fluoreszierende Protein (GFP) war die erste praktische Anwendung dieses Phänomens zur Erforschung der lebenden mikroskopischen Welt. In den frühen 90er Jahren fand man heraus, dass der Einbau des GFP-Gens in andere lebende Organismen und dessen Expression dazu führten, dass Organismen, die von Natur aus keine Fluoreszenz erzeugen, grün fluoreszieren. Seitdem wurden die verfügbaren Farben, die Lichtintensität, die Stabilität und andere Eigenschaften durch Analyse der Struktur und Mechanismen von GFP weiter verbessert und so die Entwicklung und Anwendung von fluoreszierenden Proteinen (FPs) im Bioimaging erheblich vorangebracht (Abbildung 1).
Abbildung 1: Mehrfarbige Fluoreszenzaufnahme eines Drosophila-Larvenhinterleibs, in der das F-Actin gelb und die Zellkerne grün dargestellt sind und die Lipidtropfen durch Farbzuweisung in einer intensitometrischen Lookup-Tabelle (LUT) abgebildet sind.
Obwohl die Familie der fluoreszierenden Proteine immer größer wird, ist ihr Anwendungsbereich immer noch begrenzt. Das Emissionsspektrum von fluoreszierenden Proteinen ist breit und asymmetrisch, was zu häufigen gegenseitigen Störungen bei gleichzeitiger Mehrkanal-Bildgebung führt. Durch chemische Synthese entstanden organische Farbstoffe mit großer Vielfalt und einfacher Handhabung, die nicht nur den Anwendungsbereich der Fluoreszenzbildgebung erheblich erweiterten, sondern auch die kommerzielle Standardproduktion erleichterten und damit eine solide Grundlage für einen neuen Entwicklungssprung schufen.
Nanomaterialien bringen Fortschritte im Bioimaging
Nach und nach erwiesen sich bestimmte Nachteile organischer Farbstoffe, z. B. die geringe Fluoreszenzeffizienz und schlechte Photostabilität, als Hemmnisse für die Weiterentwicklung der Fluoreszenzbildgebung. Nanomaterialien hingegen eröffnen aufgrund ihrer besonderen optischen Eigenschaften, der gerichteten Synthese und Assemblierung sowie anderer Vorteile neue Möglichkeiten. Derzeit gängige fluoreszierende Nanomaterialien (Abbildung 2):
- Halbleiter-Quantenpunkte (QDs),
- Seltene Erden-Rohstoffe für die Aufwärtskonvertierung (Upconversion Nanoparticles, UCNPs),
- Edelmetall-Nanopartikel
Im Vergleich zu anderen Farbstoffen haben fluoreszierende Nanomaterialien Vorteile wie hohe Quantenausbeute, hohe Stabilität, große Stokes-Verschiebung, ein breites Anregungsspektrum und ein enges Emissionsspektrum. Die Emissionswellenlängen können durch Anpassung der Größe verändert werden. Ihre Biokompatibilität sowie ihre Erkennungs- und Sensorfunktionen können durch Assemblierung und Modifikationen verbessert werden. Alles in allem bieten Nanomaterialien ein hervorragendes Potenzial für die Fluoreszenzmarkierung und die Zukunft der Fluoreszenzbildgebung.
Abbildung 2: Illustrierte Beispiele organischer und anorganischer Nanopartikel mit Größe, Form und Materialien
Grundlegender Arbeitsablauf bei fluoreszierenden Nanosonden
Da es sich um einen interdisziplinären Prozess unter Einbeziehung von Nanochemie und Bioimaging handelt, unterscheidet sich der Arbeitsablauf bei der Entwicklung fluoreszierender Nanosonden von dem beim herkömmlichen Bioimaging. Es ist ein mehrstufiger Prozess, der theoretische Berechnungen, chemische Synthese, Bioimaging und selbst medizinische Tests umfasst (Abbildung 3).
Abbildung 3: Grundlegender Arbeitsablauf bei fluoreszierenden Nanosonden
Die Forschungsprozesse mit fluoreszierenden Nanosonden sind meist anwendungsorientiert. Fluoreszierende Nanosonden werden beim Bioimaging sowohl für In-vitro-Proben als auch für die dynamische In-vivo-Bildgebung und selbst in der medizinischen Diagnostik und in medizinischen Studien eingesetzt. Bei der Entwicklung der Nanosonde wird daher die biologische Anwendung berücksichtigt. Es werden Nanomaterialien mit besonderen optischen Eigenschaften oder anderen Funktionen (z. B. für nahes Infrarot, Aufwärtskonvertierung, Zwei-Photonen-Mikroskopie usw.) entsprechend den konkreten Anforderungen der biologischen Anwendungen ausgewählt und anschließend synthetisiert und charakterisiert, um hochwertige Nanomaterialien zu finden. Anschließend werden die Sonden weiter modifiziert und unter Berücksichtigung ihrer Biokompatibilität bzw. der Anforderungen an ihre Funktion, wie optische Manipulation, Beladung mit Arzneistoffen, molekulare Erkennung usw., zusammengesetzt (Abbildung 4).
Abbildung 4: 3D-Darstellung von funktionalisierten Gold-Nanosonden (GNPs), beschichtet mit grün fluoreszierenden Proteinen (GFP) und Zitronensäuremolekülen
In der Forschung zu fluoreszierenden Nanosonden wird die optische Mikroskopie hauptsächlich in drei Bereichen eingesetzt: zur Charakterisierung, beim Screening hochwertiger Nanomaterialien und zur In-vivo-Erkennung von Nanosonden. Beim Screening sind die Eigenschaften verschiedener Partikel aufgrund ihrer inhärenten strukturellen Heterogenität oft sehr unterschiedlich. Im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden, die sich auf die Summe der Eigenschaften einer großen Partikelanzahl stützen, ermöglicht die optische Mikroskopie das Screening hochwertiger Sonden auf Einzelpartikelebene und die weitere Untersuchung der Zusammenhänge zwischen Struktur und Funktion im Hinblick auf ihr Design und ihre Synthese. Beim Bioimaging ermöglicht die optische Mikroskopie die Erfassung optischer Signale von Nanosonden in vivo, um dynamische räumliche und zeitliche Reaktionen abzubilden und zu verfolgen.
Anwendungen fluoreszierender Nanosonden und Mikroskopielösungen in der Forschung
Bildgebung im nahen Infrarot/Aufwärtskonvertierung mit FV3000 Red NIR
Die Bildgebung im nahen Infrarotspektrum ist derzeit ein Forschungsschwerpunkt in der optischen Mikroskopie, da Licht diese Wellenlängen tief in das Gewebe eindringen kann, die Phototoxizität niedrig ist und wenig Intereferenz durch Gewebeautofluoreszenz vorliegt Fluoreszierende Nanosonden, z. B. Quantenpunkte, können durch Anpassung ihrer chemischen Zusammensetzung, Morphologie und Größe leicht eine NIR-Anregung erreichen. Darüber hinaus haben aufwärtskonvertierende Nanomaterialien eine besondere optische Eigenschaft, die gerade für die NIR-Bildgebung interessant ist: Sie emittieren Licht mit einer kürzeren Wellenlänge (sichtbares oder UV-Licht) als das Anregungslicht, wenn sie mit langwelligem Licht (im NIR-Spektrum) angeregt werden. Aufgrund dieser Vorteile gelten aufwärtskonvertierende Nanosonden als fluoreszierende Biomarker einer neuen Generation und dürften eine wichtige Rolle in der Biomedizin, der Energie- und Katalyseforschung und anderen Bereichen spielen.
Der empfindliche In-vivo-Echtzeitnachweis von Hepatotoxizität ist derzeit ein Engpass bei der Diagnose von arzneimittelinduzierten Leberschäden. In einer im Jahr 2020 veröffentlichten Arbeit der Forschungsgruppe von Professor Li Huijun wurde eine aufwärtskonvertierende Nanosonde entwickelt, die aus aufwärtskonvertierenden Nanopartikeln (UCNPs) und Goldnanostäbchen (GNR) besteht und zur Echtzeit-Diagnose von arzneimittelbedingten Leberschäden in situ eingesetzt wird. Diese neuartige Nanosonde kann in der Leber aggregieren und durch einen Marker für Leberschäden, miR122, spezifisch aktiviert werden. Sie erzeugt Fluoreszenzbilder bei 800 nm, wenn sie durch Licht im nahen Infrarotspektrum bei 980 nm angeregt wird. Durch Kombination mit Lumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (LRET) und einer Signalverstärkungstechnologie wird die Erkennungsempfindlichkeit weiter erhöht, sodass eine hochempfindliche Detektion von miR122 erreicht und damit ein neuer Ansatz für die klinische Echtzeit-Überwachung von arzneimittelinduzierten Leberschäden verfügbar wird. [4]
Im Gegensatz zur konventionellen konfokalen Bildgebung erfordert die Bildgebung von NIR-/aufwärtskonvertierenden Nanosonden Geräte mit spezifischen Eigenschaften:
- In der konventionellen konfokalen Mikroskopie werden üblicherweise Anregungswellenlängen von 400–650 nm verwendet, während für die Bildgebung im nahen Infrarotspektrum NIR-Laser mit Wellenlängen > 700 nm erforderlich sind.
- Die meisten Komponenten im optischen Strahlenweg, die in der konventionellen Bildgebung verwendet werden, z. B. Scanning-Galvanometer, Objektive und Beugungsgitter, unterstützen nur die Antireflexion/Kalibrierung im sichtbaren Spektrum und erreichen nicht die Effizienz und Genauigkeit der NIR-Bildgebung.
- Eine NIR-Detektion erfordert spezielle > 750 nm NIR-Detektoren
Um diesen Anforderungen gerecht zu werden, verfügt das Laser-Konfokalmikroskop FLUOVIEW FV3000 über eine NIR-Bildgebungslösung (Abbildung 5). Die FV3000 Red Bildgebungslösung basiert auf einem bewährten System und ist speziell für die hochempfindliche und genaue NIR-Bildgebung mit mehreren Farben bestimmt.
NIR-Bildgebungslösung mit dem FV3000 Red Laser für das nahe Infrarotspektrum: Optimierung optischer Komponenten für das nahe Infrarotspektrum: X Line Objektive: Dedizierte NIR-Detektoren: |  |
Abbildung 5: Das modulare konfokale Laserscanning-System FLUOVIEW FV3000 bietet mit dem FV3000 Red eine Lösung für die NIR-Bildgebung. |
In diesem Anwendungshinweis, der in Zusammenarbeit mit Dr. Kai Li (Southern University of Science and Technology, China) erarbeitet wurde, finden Sie Informationen zum erfolgreichen Einsatz der FV3000 NIR-Lösung zur Abbildung von Nanopartikeln auf der Basis von NIR-II-Molekülen (BTB) in den Gefäßen der Ohren, Hintergliedmaßen und des Gehirns von Mäusen mit Tumoren (Abbildung 6).
Abbildung 6: Die Forscher dieser Studie modifizierten die Oberfläche der BTB-Nanosonde mit dem Arg-Gly-Asp(RGD)-Targetingpeptid und beobachteten bei Mäusen, denen BTB-RGD NPs injiziert wurden, im Laufe von 48 Stunden eine signifikante Zunahme des NIR-II-Fluoreszenzsignals an der Tumorstelle im Vergleich zur BTB-Nanosonde.
In-vivo-Darstellung von Tumormarkern mit der FVMPE-RS Deep-Detection-Lösung
Krebs ist eines der größten Gesundheitsprobleme in unserer Gesellschaft. Die frühzeitige Diagnose und die präzise Entfernung bösartiger Tumore zählen zu den obersten Prioritäten der aktuellen medizinischen Forschung. Entwurf und Entwicklung neuartiger fluoreszierender Nanosonden zur spezifischen Identifizierung von Tumormarkern und die hochauflösende In-vivo-Bildgebung ermöglichen neue Nachweismethoden zur klinischen Frühdiagnose bösartiger Tumore und ihrer präzisen chirurgischen Entfernung.
Die Überexpression von Enzymen wie der alkalischen Phosphatase (ALP) in Tumorzellen ist ein wichtiger klinischer Indikator für das Auftreten, die Entwicklung und das Fortschreiten von Tumoren. Daher kann eine schnelle Nachweismethode mit hoher Empfindlichkeit für die ALP-Aktivität bei der Früherkennung und genauen Entfernung von Tumoren helfen. Im Jahr 2020 veröffentlichten Professor Xiaojun Peng und sein Team eine Arbeit über den Einsatz einer Nanosonde, die genau für diesen Zweck entwickelt wurde. In der Arbeit werden die Entwicklung und Herstellung einer AIEgen-Sonde (DQM-ALP) beschrieben, die nach der Interaktion mit überexprimierter ALP in Tumorzellen bei der Aggregation starke Fluoreszenz abgibt. Diese Nanosonde vermeidet das Problem der Fluoreszenzabschwächung, das bei herkömmlichen organischen Farbstoffen durch Aggregation entsteht, und erhöht dadurch die Erkennungsempfindlichkeit und Verweildauer der Sonde in Tumorzellen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmals die Hochregulierung der ALP-Aktivität in Tumorzellen durch Natriumbutyrat und Cortisolstimulation entdeckt. Um die dreidimensionale Tiefendarstellung der ALP-Aktivität in HeLa- und HepG-2-Tumor-Sphäroiden mit hoher räumlicher Auflösung zu erreichen, wurde die Zwei-Photonen-Mikroskopie eingesetzt. Der Artikel zeigt die Eignung der Sonde zur Fluoreszenzdetektion von Submillimetertumoren als leistungsfähiges Hilfsmittel für die klinische Diagnose und die chirurgische Entfernung von Tumoren auf. [5]
In der oben genannten Studie wurden konfokale Ein- und Zwei-Photonen-Mikroskope verwendet. Das neueste FVMPE-RS-Multiphotonenmikroskop, das für tiefe Fluoreszenzbildgebung in-vivo mit einem proprietären Hochgeschwindigkeits-Resonanz-Scanning-Galvanometer und einem hochempfindlichen optischen Detektionspfad entwickelt wurde, ermöglicht jedoch eine genauere und effizientere hochauflösende 3D-Tiefenbildgebung von Tumormarkern (Abbildung 7).
Die Kombination aus zwei Linien-/Doppellasern und hochempfindlicher Detektion auf bis zu vier Kanälen des FVMPE-RS-Systems ermöglicht eine flexiblere, mehrfarbige synchronisierte Bildgebung, die den Durchsatz und die Effizienz bei der Detektion weiter verbessert. Darüber hinaus kann der unabhängige Photoanregungsscanner eine präzise räumliche Anregung durch einen Femtosekundenlaser erreichen. Durch diese Präzisionsanregung und die schnelle synchronisierte Signalerfassung ist das System sehr effektiv für die Lichtkontrolle, photodynamische und andere spezielle Nanosonden-Detektionsanwendungen.
Effiziente Infrarotanregung: Betrachtung tiefer Schichten: Hochgeschwindigkeits-Scannen: Mehrfarbige Multiphotonen-Bildgebung: Flexiblere Lichtstimulation: |  |
Abbildung 7: Multiphotonensystem FVMPE-RS mit Modulen für die Tiefenbildgebung |
Dynamische Detektion von Nanosonden in lebenden Zellen mit IXplore SpinSR Rapid Super Resolution
Biochemische Reaktionen und andere molekulare Ereignisse in lebenden Zellen weisen oft eine erhebliche räumliche und zeitliche Dynamik auf. Die optische Bildgebungstechnologie kann die Bewegung von Nanosonden genau verfolgen und ihre Wechselwirkungen mit Biomolekülen untersuchen. Damit können diese Biomarker effektiv überwacht und dynamische Veränderungen beobachtet werden, um die Zusammenhänge zwischen deren Zuständen und relevanten Zellfunktionen weiter zu erforschen. Endosomen, Lysosomen und andere Organellen spielen eine Schlüsselrolle bei der Signalübertragung und der Aufrechterhaltung der Stoffwechselhomöostase. Da sich die pH-Werte dieser Organellen während der Endozytose ändern, steht die schnelle und empfindliche Bestimmung der pH-Werte dieser Organellen im Mittelpunkt der Forschung zur dynamischen Überwachung des Endozytoseprozesses und zur Erforschung der Beziehungen zwischen deren Zuständen und den Zellfunktionen.
Im Jahr 2016 stellte das Forschungsteam von Professor Yiguang Wang der Universität Peking und Professor Jinming Gao des Southwestern Medical Center der University of Texas eine ultraempfindliche pH-Nanosonde (HyUPS) mit Einzelorganellen-Auflösung vor. Mit dieser Nanosonde konnten sie pH-Änderungen in Endosomen/Lysosomen und anderen Organellen während der Endozytose verfolgen und erkennen. Die Sonde enthält drei pH-empfindliche Komponenten, die den drei Komponenten der Endozytose und drei pH-Bereichen entsprechen und mit roten, grünen bzw. blauen Fluorophoren markiert sind. Die Sonde ermöglichte erfolgreich die dynamische Echtzeit- und Mehrfarbenüberwachung der Azidifizierungsrate in Organellen, die an der Endozytose in lebenden Zellen beteiligt sind, und stellt damit ein neues Bildgebungsinstrument für weitere Studien über Erkrankungen infolge einer endosomalen/lysosomalen Dysfunktion dar. [6]
Die Bildgebung von Nanosonden in einer lebenden Probe erfordert Hochgeschwindigkeits-Bildgebungsgeräte, die herkömmliche konfokale Punktabtastung wird den Anforderungen nicht gerecht. Das konfokale IXplore SpinSR Bildgebungssystem mit Spinning-Disk und Super Resolution kann schnelle (200 fps) Mehrfarbenbilder in Superauflösungsqualität (110 nm) darstellen (Abbildung 8). Dadurch wird es möglich, die schnellen dynamischen Prozesse feiner Strukturen zu erfassen. Das System wird damit zu einem leistungsstarken Werkzeug zur Verbesserung der Bildgebungseffizienz in den Biowissenschaften. Der firmeneigene RTCe (Echtzeit-Controller) steuert den synchronisierten Betrieb aller Komponenten, um die Auswirkungen des Anregungslichts auf die Proben zu minimieren. Dieser Vorteil ermöglicht in Kombination mit Silikonöl-Objektiven speziell für die Tiefenbiopsie eine langfristig präzise Tiefenbildgebung von lebenden Zellen, Sphäroiden und organoiden Proben.
Ein Beispiel für die hochauflösende Bildgebung des IXplore SpinSR-Systems finden Sie in Abbildung 9, die mit PKMDR-Farbstoff markierte Mitochondrien von Epithelzellen zeigt. Die von Professor Zhixing Chen der Universität Peking entwickelte PKMDR ist eine mitochondriale Sonde, welche die Phototoxizität bei Fluoreszenz- und nanoskopischer Bildgebung minimiert.
Konfokales IXplore SpinSR System mit Spinning Disk
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Abbildung 8: Konfokales IXplore SpinSR Bildgebungssystem mit Spinning Disk und Superauflösung |
Abbildung 9: Hochauflösendes Bild von Epithelzellmitochondrien, markiert mit PKMDR-Farbstoff unter Verwendung des IXplore SpinSR-Systems, des Objektivs UPLAPO60XOHR und der TruSight-Verarbeitung. Bild mit freundlicher Genehmigung: Dr. Huiwen Hao, Dr. Junsheng Yang, Prof. Yujie Sun und Prof. Zhixing Chen. Standard Imaging Co., Ltd. und Sun Lab, College of Future Technology, PKU. NanJing GenVivo Biotech Co., Ltd.
In den letzten zehn Jahren wurden dank der rasanten Entwicklung der Nanotechnologie und der Technologien für die optische Bildgebung viele wichtige Fortschritte in biochemischen Bildgebungsanwendungen unter Verwendung fluoreszierender Nanosonden erzielt Die Anwendung fluoreszierender Nanosonden ist jedoch noch immer durch ihre begrenzte Biokompatibilität, auftretendes Fluoreszenzblinken und andere Unzulänglichkeiten eingeschränkt. Mit der kontinuierlichen Entwicklung und Integration von Nanomaterialien und Bioimagingtechnologien, chemischer Synthese, theoretischer Physik und Bildanalyse dürften sich die Spezifität, Genauigkeit, Stabilität und Reproduzierbarkeit des Bioimagings mit fluoreszierenden Nanosonden weiter verbessern, sodass dieses dank seines Potenzials eine wichtige Rolle in diversen Forschungsbereichen spielen kann.
Literaturnachweise:
[2]. Chang, H., Xie, J., Zhao, B., Liu, B., Xu, S., Ren, N., Xie, X., Huang, L., & Huang, W. (2014). Rare Earth Ion-Doped Upconversion Nanocrystals: Synthesis and Surface Modification. Nanomaterials (Basel, Schweiz), 5(1), 1–25.
[3]. Chen, Z., Wu, X., Hu, S., Hu, P., & Liu, Y. Multicolor upconversion NaLuF4 fluorescent nanoprobe for plant cell imaging and detection of sodium fluorescein. J. Mater. Chem. C, 2015, 3, 153-161
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