Digitalización de muestras fluorescentes muy gruesas con el escáner de portaobjetos dedicado a la investigación SLIDEVIEW VS200

Introducción

Los investigadores del Instituto de Biología Celular Molecular y Genética de la sociedad Max Planck (MPI-CBG), ubicado en Dresde, Alemania, investigan las capacidades de regeneración del platelminto (o planaria) Schmidtea mediterranea con el escáner de portaobjetos para la investigación SLIDEVIEW VS200 de Olympus. El platelminto (o planaria) Schmidtea mediterranea es un espécimen muy usado para estudios biológicos asociados a la regeneración de sistemas.

Las ventajas que destacan al usar el platelminto S. mediterranea son las siguientes:

1. Bajo costo por el mantenimiento de una cantidad responsable de animales en laboratorio.
2. Genoma recientemente secuenciado.
3. Herramientas y métodos establecidos para estudiar la pérdida de expresión del gen mediante la interferencia por ARN (RNA interference, RNAi).

Entender las capacidades de regeneración del platelminto Schmidtea Mediterranea

Los investigadores del MPI-CBG están utilizando las extraordinarias cualidades del platelminto (o planaria) Schmidtea mediterranea. Esta especie de tricládido planárido de agua dulce, incluso al ser cortado en pequeños trozos, puede regenerarse en un nuevo platelminto, de forma completa y perfectamente proporcionada. Las células madre adultas juegan un papel esencial en este proceso, ya que una sola puede restaurar un gusano completo.

En la actualidad, muchos investigadores buscan entender de modo más claro cómo se regenera el platelminto Schmidtea mediterranea. Un avance importante hacia este objetivo fue a través del primer ensamblaje de genoma altamente contiguo de S. mediterranea, el cual fue dado a conocer por los investigadores del MPI-CBG, en cooperación con el Instituto de Estudios Teóricos de Heidelberg (HITS), en un artículo de la revista científica Nature.*

El ensamblaje revela un genoma que contiene nuevos elementos gigantes de repetición y nuevos genes específicos de los platelmintos (tb., gusanos planos). Sin embargo, carece de otros genes que se creía eran absolutamente esenciales para que un animal viva. Este descubrimiento tiene implicaciones potenciales en los campos de la investigación de la regeneración, la biología de las células madre y la bioinformática.

Captura de imágenes de fluorescencia de alta resolución del platelminto Schmidtea Mediterranea

En los estudios de los investigadores del MPI-CBG, se han usado las poderosas capacidades de los sistemas de escaneo de portaobjetos. Específicamente, se utilizó el escáner de portaobjetos VS200 para adquirir imágenes de fluorescencia de alta resolución.

«El escáner VS200 de Olympus no sólo nos permite adquirir fácilmente imágenes de alta resolución, sino que también proporciona la función TruSight Live: una función para corregir el desenfoque en tiempo real», explicó el Dr. Tobias Boothe de MPI-CBG.

Los especímenes preparados son bastante gruesos ya que no son cortados antes de ser inmovilizados en un portaobjetos. En vista del espécimen grueso de 200-300 μm, las funciones TruSight Live o Apilamiento en Z (Z-stack) del sistema son esenciales.

La opción TruSight Live permite a los investigadores reducir la luz difusa que interfiere en las áreas por encima y por debajo del plano de enfoque. A continuación, los datos de la imagen son calculados nuevamente aplicando un algoritmo especial de deconvolución 2D. Esto hace que las imágenes sean más nítidas y claras.

En el contexto de esta investigación, primero se inmovilizó el S. mediterranea en un portaobjetos; se tiñó con hibridación in situ de doble fluorescencia (rojo y verde) sobre dos marcadores de la glándula vitelina en individuos sexualmente maduros; y, se escaneó a 10 aumentos en un sistema de escaneo de portaobjetos VS200. También, se adquirió la contratinción nuclear con DAPI. Los dos marcadores eran la ferritina y la proteína surfactante B: ambos marcan el vitelario del platelminto.

La imagen a la izquierda muestra un escaneo en el que no se aplicó ninguna corrección de desenfoque en línea. En la imagen a la derecha, se aplicó la función TruSight Live a los tres canales (DAPI, FITC y CY3) durante el escaneo.

S. mediterranea teñido con hibridación in situ de doble fluorescencia (rojo y verde) y contratinción DAPI, escaneado a 10×. Izquierda: Sin corrección de desenfoque en línea. Derecha: Con corrección de desenfoque en línea aplicada a los tres canales (DAPI, FITC y CY3). La imagen de la derecha es más clara que la de la izquierda, ya que se elimina el resplandecimiento alrededor de cada señal. Imágenes por cortesía de Miquel Vila-Farré, MPI-CBG.

«Las imágenes y los datos que hasta hoy se han adquirido son un recurso esencial para la investigación en curso con el fin de comprender la relación entre la abundancia de tejido reproductivo de los platelmitos adultos y la capacidad de regeneración del animal. Por ende, se requieren múltiples marcadores, como la proteína surfactante B y la ferritina, tal y como se muestra en la imagen», explicó el Dr. Miquel Vila-Farré de MPI-CBG.

Una alternativa a la función TruSight Live puede ser la adquisición de apilamiento en Z ( Z-stack) virtual que contiene un máximo de 31 niveles, como se muestran en las imágenes a continuación.

S. mediterranea teñido con hibridación in situ de doble fluorescencia (rojo y verde) y escaneado a 10×. Izquierda: Apilamiento en Z virtual que contiene 31 niveles. Derecha: Imagen con un nivel. Imágenes por cortesía de Miquel Vila-Farré, MPI-CBG.

Después de completar la adquisición de la imagen, es posible hacer un enfoque sin problemas a través del apilamiento en Z (Z-stack) para observar la distribución de la señal a través del espesor de la muestra.

En el siguiente ejemplo de imagen, se ve una hibridación in situ con doble fluorescencia sobre dos marcadores del sistema excretor en el platelminto (planaria) Schmidtea mediterránea: Smed-cubilin-1 (FITC, verde) y un gen nuevo (dd_2920, CY3 rojo). El marcador DAPI (azul) se usó para la tinción nuclear. «A fin de comparar la organización estructural del sistema excretor del platelminto con la del nefrón vertebrado, se utilizaron Smed-cubilin-1 y dd_2920 como marcadores para visualizar dos tipos de células diferentes del sistema excretor del platelminto: la célula tubular proximal y la célula de filtración, respectivamente», mencionó el Dr. Hanh Vu del MPI-CBG.

Hibridación fluorescente doble (rojo y verde) in situ de dos marcadores para el sistema excretor del platelminto S. mediterranea.

Conclusión

El escáner de portaobjetos dedicado a la investigación VS200 de Olympus captura imágenes de fluorescencia de alta resolución a partir de muestras muy gruesas, como el platelminto (o planaria) Schmidtea Mediterranea. Sus funciones TruSight Live y Apilamiento en Z (Z-stack) ofrecen capacidades cruciales que permiten a los investigadores observar y analizar los finos detalles de dichas muestras.

Agradecimientos
Esta nota de aplicación ha sido elaborada gracias a la colaboración de los investigadores del Instituto de Biología Celular Molecular y Genética de la sociedad Max Planck, ubicado en Dresde, Sajonia, Alemania, y el Dr. Daniel Göttel, Especialista de aplicaciones, División de Soluciones Software para el Procesamiento de Imágenes de Olympus [Olympus Soft Imaging Solutions in Münster], Münster, Alemania.

• Dr. Tobias Boothe, Estudiante posdoctoral en el Instituto de Biología Celular y Genética Molecular de la sociedad Max Planck, Dresde, Sajonia, Alemania.
• Dr. Miquel Vila-Farré, Investigador posdoctoral en el Instituto de Biología Celular y Genética Molecular de la sociedad Max Planck, Dresde, Sajonia, Alemania.
• Dr. Hanh Vu, Investigador posdoctoral en el Instituto de Biología Celular y Genética Molecular de la sociedad Max Planck, Dresde, Sajonia, Alemania.
• Dr. Daniel Göttel, Especialista de aplicaciones, División de Soluciones Software para el Procesamiento de Imágenes de Olympus [Olympus Soft Imaging Solutions GmbH], Münster, Alemania;

Referencias
*Nature; 24 de enero de 2018 (DOI: 10.1038/nature25473).