Monitorización del proceso global de diferenciación de orgánulos de hígado derivados de células iPS humanas usando el sistema de inspección de incubación CM20

Descripción

Recientemente se ha avanzado en la creación in vitro de órganos/tejidos en miniatura, denominados orgánulos, de células madre pluripotentes humanas incluyendo células madres pluripotentes inducidas (iPS). Los orgánulos humanos ofrecen oportunidades únicas en una amplia gama de campos, que van de la biología de desarrollo básico al modelado de enfermedades y el desarrollo de fármacos.

Antecedentes experimentales

En general, los orgánulos se forman a través de la auto-organización, en la que las células de composición se ordenan espacialmente en ubicaciones apropiadas para determinar sus destinos de diferenciación en tipos de células específicas. El objetivo de todo ello es obtener la expresión de las funciones de los órganos en última instancia. El proceso de derivar las células iPS humanas no diferenciadas a los orgánulos de un órgano de destino requiere un largo periodo de tiempo, al menos de un mes o más. Esta duración tan prolongada se debe a la existencia de diversas fases de células diferenciadas intermedias que se corresponden con las fases de desarrollo. En muchos casos, estos procesos también incluyen los pasos de integrar las células en una matriz extracelular que contiene componentes de membrana basal, que es fundamental para la polarización de las células y el posterior mantenimiento de las estructuras tridimensionales. En otras palabras, para poder generar orgánulos de forma correcta y reproducible de una cierta calidad a partir de células iPS humanas, es necesario realizar una evaluación cuidadosa de las condiciones de los cultivos bidimensionales y tridimensionales. Específicamente, además del control de calidad de las células iPS, es importante monitorizar a la perfección los procesos de diferenciación en un periodo de tiempo prolongado, con recopilación de datos sobre las conductas tridimensionales y la morfogénesis de las poblaciones celulares.

En esta nota de aplicación, hemos intentado observar el proceso de diferenciación usando el sistema de inspección de incubación Provi CM20 de Olympus. Hemos usado nuestro método publicado recientemente para generar orgánulos de hígado humano ^1,2 como ejemplo de modelo.

Observación de los cambios morfológicos durante la formación del intestino anterior y posterior.

Hemos utilizado el sistema CM20 para demostrar si es posible observar los cambios morfológicos tridimensionales en el proceso de diferenciación de células iPS humanas no diferenciadas en un endodermo definitivo similar a una capa en dos dimensiones y la emergencia posterior de esferoides en el intestino anterior y posterior.

Resultados

El sistema CM20 nos permitió observar, no solo el proceso del mantenimiento de los cultivos de células iPS humanas, sino también su diferenciación en el endodermo definitivo y la posterior emergencia de esferoides en el intestino anterior y posterior. Estos esferoides del intestino anterior y posterior se generaron a través de la formación autónoma celular de agregados de células tridimensionales derivadas de la capa celular en dos dimensiones, lo que demuestra que el proceso de estos cambios morfológicos puede seguirse con el sistema CM20. Dado que los orgánulos de otros órganos endodérmicos, como el estómago y el intestino, también se derivan de esferoides de intestino primitivo originados en el endordermo definitivo, nosotros proponemos que el sistema CM20 pueda aplicarse ampliamente para monitorizar el proceso de diferenciación de dichos orgánulos.

Observación del proceso de cultivo de orgánulos de hígado en Matrigel

El sistema CM20^*1 nos permitió demostrar que era posible observar el proceso de cultivo de orgánulos de hígado en tres dimensiones que se diferencian y crecen en Matrigel.

Resultados

El sistema CM20 nos permitió hacer un seguimiento del proceso de diferenciación de los orgánulos de hígado en cultivos tridimensionales usando gotas de Matrigel en una placa de 24 pocillos durante 2 semanas aproximadamente.

Conclusión

Las funciones de monitorización automática del software del sistema CM20 permiten hacer un seguimiento del proceso de diferenciación que provoca los cambios morfológicos, así como el proceso de crecimiento de los orgánulos en tres dimensiones en gel de matriz extracelular. Nuestro experimento demostró que el sistema CM20 puede hacer un seguimiento del proceso de cultivo a largo plazo, desde el mantenimiento y la gestión de células iPS humanas a su diferenciación en orgánulos, además de contribuir a la optimización y el control de calidad de los cultivos celulares.

Comentarios del Dr. Takebe y el Dr. Yoneyama

Referencias

1. Rie Ouchi, Shodai Togo, Masaki Kimura, Tadahiro Shinozawa, Masaru Koido , Hiroyuki Koike, Wendy Thompson, Rebekah A Karns, et al., “Modeling Steatohepatitis in Humans with Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids.” 2019 Aug 6;30(2):374-384.e6. doi: 10.1016/j.cmet.2019.05.007. Epub 2019 May 30. PMID: 31155493 PMCID: PMC6687537 DOI: 10.1016/j.cmet.2019.05.007
2. Tadahiro Shinozawa, Masaki Kimura, Yuqi Cai, Norikazu Saiki, Yosuke Yoneyama, Rie Ouchi, Hiroyuki Koike, Mari Maezawa, et al., “High-Fidelity Drug-Induced Liver Injury Screen Using Human Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids.” 2021 Feb;160(3):831-846.e10. doi: 10.1053/j.gastro.2020.10.002. Epub 2020 Oct 8. PMID: 33039464 PMCID: PMC7878295 (disponible el 2022-02-01) DOI: 10.1053/j.gastro.2020.10.002

*1 Usando las funciones añadidas a la versión 1.2.4 o posterior del sistema Provi CM20 de Olympus. Descargue la actualización o lea las notas de versión del software para obtener más información.