Análisis de imágenes fluorescentes: ensayo en directo de células muertas de esferoides

El índice de células muertas dentro de los esferoides y la eficacia del fármaco pueden evaluarse cuantitativamente usando un microscopio confocal y el módulo de recuento celular del software NoviSight™.

Objetivos

La distancia de la superficie de un tumor al núcleo tiene un gradiente de difusión de oxígeno o nutrientes, y este entorno tan severo provocan células durmientes o células muertas a gran profundidad del tejido tumoral. Se prevé que un modelo de esferoide recapitule el microentorno tumoral. Anteriormente, cada sección tenía que prepararse por separado para poder observar el interior de las muestras 3D. Ahora, el desarrollo de la tecnología de lavado del tejido permite observar el interior de las muestras 3D a la vez que  se preserva su integridad estructural. En este estudio, las imágenes confocales de esferoides cancerígenos teñidos con fluorescencia, tratados con un fármaco, fijados y transparentes, se sometieron a un análisis cuantitativo 3D usando el software NoviSight™. El estudio demuestra que la muerte celular supeditada al fármaco e independiente del fármaco puede confirmarse usando un reactivo de lavado y el software NoviSight™.

Preparación de las muestras

Se cultivó una suspensión celular de HT-29 en placas PrimeSurface®96U  (SUMITOMO BAKELITE CO., LTD), con base en U con una proporción de 500 células/pocillo. Se añadió estaurosporina (STS) en varias concentraciones y NucView550 en cada pocillo 8 días después del inicio del cultivo celular. Después de un periodo de incubación de 1 día, las células se fijaron con paraformaldehído al 4 % y se permeabilizaron con TritonX-100/PBS al 0,5 %. A continuación, el núcleo celular se tiñó con Hoechst 33342 durante la noche a 4 ºC y los esferoides se hicieron transparentes con ScaleS.

Conclusión
Adquisición y análisis de imágenes fluorescentes

Las imágenes fluorescentes confocales de los esferoides mencionados anteriormente se obtuvieron usando el microscopio láser confocal FV3000. Incluso en ausencia del STS, el núcleo celular profundo dentro de los esferoides se tiñó con NucView550 (A), indicando la ocurrencia de la apoptosis. El reconocimiento del núcleo celular y el análisis del recuento celular con el software NoviSight™ permite cuantificar la proporción de células muertas (B), y confirmó que la muerte celular inducida por el STS ocurrió de forma supeditada a la dosis (C, D). Estos resultados demuestran que el software NoviSight™ puede contribuir a la evaluación cuantitativa de la muerte celular 3D inducida por los fármacos.

PrimeSurface es una marca registrada de Sumitomo Bakelite Co., Ltd.
Olympus es una marca registrada, y NoviSight and Insightful Analysis, Intelligent Answers son marcas comerciales de Olympus Corporation.