El contraste de modulación de Hoffman, también conocido como contraste de relieve, es una técnica de microscopía óptica desarrollada para aumentar el contraste de materias vivas y no teñidas que se hallan en recipientes de plástico. Esta detecta gradientes ópticos y los convierte en variaciones de intensidad de luz.

A través de esta publicación, se explora el contraste de modulación de Hoffman con detalle, desde la configuración básica del microscopio hasta las ventajas y limitaciones.

Figura 1 Configuración básica del microscopio para el contraste de modulación Hoffman

Configuración básica del microscopio para el contraste de modulación de Hoffman

La Figura 1 muestra la configuración básica del microscopio para el contraste de modulación Hoffman. Un filtro espacial de amplitud óptica, denominado «modulador» por Hoffman, es introducido en el plano focal posterior de un objetivo. La intensidad de luz que atraviesa este sistema varía por encima y por debajo de un valor medio, que será modulado posteriormente. Los objetivos útiles para el contraste de modulación pueden cubrir toda la escala de magnificación de 10X, 20X y 40X.

El modulador presenta tres zonas (representadas en la Figura 2):

• Una zona oscura pequeña, que se halla cerca de la periferia del plano focal posterior y transmite sólo el 1 % de la luz (áreas marcadas con D en la Figura 2).
• Una zona gris angosta que transmite el 15 % de la luz (áreas marcadas con G en la Figura 2)
• Una zona clara o transparente restante, que cubre la mayor parte del área en la parte posterior del objetivo y transmite el 100 % de la luz (áreas marcadas con una B en la Figura 2)

A diferencia de la placa de fase en la microscopía de contraste de fase, el modulador de Hoffman está diseñado para no alterar la fase de la luz que atraviesa las zonas mencionadas. Los objetos transparentes que son básicamente invisibles con la microscopía de campo claro convencional, al ser observados bajo la óptica de contraste de modulación, adquieren una apariencia tridimensional (3D) dictada por gradientes de fase.

En el diseño de Hoffman, las muescas están en el plano focal frontal del condensador, tal y como se ilustra en la Figura 1. Cuando la luz pasa a través de la muesca fuera de eje, ésta se refleja en el plano focal posterior del objetivo (también denominado plano de Fourier) donde el modulador se encuentra instalado. El plano focal frontal del condensador, que contiene la placa de muesca fuera de eje, se conjuga en modo óptico con el modulador presente en el plano focal posterior del objetivo. La intensidad de la imagen es proporcional a la primera derivada originaria de la densidad óptica en la muestra y está controlada por el orden cero del patrón de difracción del gradiente de fase.

Los gradientes opuestos generan la deflexión de la imagen de la muesca hacia la parte muy oscura o la sección brillante del modulador. Considere este ejemplo: una muestra hipotética, que contiene gradientes de fase (grosor) tanto positivos como negativos y un área plana (sin gradiente), es adquirida mediante componentes ópticos de contraste de modulación. El gradiente positivo desvía la luz hacia el área clara del modulador ؅—en el que ésta no se atenúa—, y el 100 % de esta luz es transmitida al plano intermedio de la imagen. Igualmente, la luz desviada por un gradiente negativo hacia el área oscura del modulador se atenúa a aproximadamente el 1 % de su valor de origen.

Cualquier parte del espécimen, que no presente gradientes, junto con el fondo se registran en la parte gris del modulador, donde aproximadamente el 15 % de la luz es transmitida al plano de imagen intermedio. Como resultado, la intensidad del área de la imagen, a partir de un lado del gradiente, será oscura. La intensidad proveniente del lado opuesto al gradiente produce un área de imagen brillante y las áreas sin gradiente aparecen grises en la imagen, al igual que el fondo.

Cuatro ventajas clave del contraste de modulación de Hoffman

Existen numerosas ventajas y algunas limitaciones en el contraste de modulación de Hoffman. Algunas de las ventajas que destacan del contraste de modulación Hoffman son:

1. Uso completo y maximizado de la apertura numérica de su objetivo

La capacidad de usar aperturas numéricas más altas junto con el contraste de modulación Hoffman favorece una excelente resolución en los detalles, además de un buen contraste y visibilidad de la muestra.

2. Funcionamiento con recipientes de plástico

El contraste de modulación de Hoffman proporciona resultados exitosos en el caso de materiales birrefractivos, como las bandejas de plástico, sin generar distorsión en la imagen. La birrefringencia, o doble refracción, es el fenómeno que se manifiesta en ciertos materiales cuando un rayo incidente (un rayo de luz que incide sobre una superficie) al atravesar el material se divide en dos.

El contraste de modulación de Hoffman es una buena alternativa para aquellos métodos de contraste que no funcionan bien con materiales birrefractivos. Por ejemplo, examinar materiales birrefractivos usando el contraste de interferencia diferencial (DIC) podría generar artefactos, pérdida de contraste y otros problemas de calidad en la imagen.

Por consiguiente, el contraste de modulación de Hoffman es un método ideal para observar y procesar imágenes de cultivos de células, tejidos y órganos en recipientes de plástico.

3. Capacidad para el seccionamiento óptico

También es posible efectuar «cortes/secciones ópticos(as)» mediante esta técnica. El seccionamiento permite centrarse en un solo plano fino de la muestra, sin interferencias provenientes de imágenes confusas que surgen en áreas por encima/debajo del plano que está siendo enfocando.

La profundidad de una muestra es medida en una dirección paralela al eje óptico del microscopio. El enfoque en la imagen determina la distancia correcta entre la muestra y la imagen; esto habilita la producción de interferencia por las ondas difractadas en un plano predeterminado (el plano de la imagen), que se sitúa a una distancia fija del ocular. Esto permite que los objetos difractados en diferentes niveles de profundidad de la muestra se vean por separado, siempre y cuando el contraste sea suficiente.

La profundidad total de una muestra puede ser seccionada de forma óptica mediante un enfoque secuencial de cada plano sucesivo. En este sistema, la profundidad de campo se refiere a la distancia de un nivel al siguiente donde se producen imágenes de distintos detalles y está controlada por la apertura numérica del objetivo. Los objetivos de mayor apertura numérica exhiben profundidades de campo muy bajas. Lo contrario se contempla en los objetivos de menor apertura numérica. La capacidad general de un objetivo para aislar y enfocar una sección óptica específica disminuye a medida que disminuye la homogeneidad óptica de la muestra.

4. Visibilidad mejorada

Otra ventaja del contraste de modulación Hoffman es la visibilidad mejorada. Las imágenes aparecen sombreadas o pseudotridimensionales, lo que mejora la visibilidad debido a las diferencias de contraste a ambos lados de un detalle. Tampoco se ven halos en las imágenes, a diferencia de las imágenes producidas con dispositivos ópticos de contraste de fase. El contraste de modulación de Hoffman convierte la información del gradiente de fase en diferencias de amplitud que son muy diferentes de las variaciones de la relación de fase (y las diferencias de la trayectoria óptica) producidas por un microscopio de contraste de fase.

El uso de las zonas oscuras y grises en el modulador produce imágenes que contienen diferentes tonos de gris y carecen de color. Es posible introducir color en imágenes de contraste de modulación al producir moduladores con zonas grises y oscuras que serán sustituidas por zonas coloreadas dotadas de valores de transmitancia idénticos. En este caso, las imágenes resultantes del gradiente de fase se reproducirán con colores por gradientes similares en el mismo tono. Por el momento, no se conoce ninguna fuente comercial de filtros de modulación que contengan zonas coloreadas.

Limitaciones en el contraste de modulación de Hoffman

Ciertamente existen desventajas o limitaciones en el contraste de modulación de Hoffman. En primer lugar, estas imágenes deben observarse con precaución. Esto se debe a que diferentes observadores pueden ver una «pendiente» como un «valle» o viceversa en la imagen, ya que la imagen pseudotridimensional es observada a través del ocular. El sistema también es muy sensible a los gradientes perpendiculares con respecto a la longitud de la muesca. Como consecuencia, esta técnica requiere cierto grado de habilidad para colocar la muestra con el fin de obtener efectos superiores.

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