Suscitar el éxito experimental mediante un flujo de trabajo sistemático para los cultivos celulares

La expansión y la modernización de los procesos de cultivo celular obran en la demanda de tecnologías capaces de aportar estandarización, documentación precisa y fiable, velocidades incrementadas y una menor carga de trabajo. A través de este informe técnico, se describirán las soluciones que soportan un flujo de trabajo eficiente y estandarizado para los cultivos celulares con el fin de favorecer el éxito experimental en las aplicaciones asociadas.

Incrementar la demanda para un flujo de trabajo de cultivo celular mejorado

Un proceso efectivo de cultivo celular sienta las bases del éxito en las aplicaciones de toda la industria de las ciencias de la vida y la farmacéutica: desde la investigación de células madre y tumores hasta la medicina regenerativa. La capacidad para observar y documentar de forma precisa las células in vitro, ya sea durante su crecimiento, proliferación o diferenciación, es vital para asegurar la calidad y la reproducibilidad a lo largo de la distribución del trabajo de cultivo celular. Para abordar este planteamiento, muchos laboratorios están introduciendo tecnologías que soportan la estandarización y la generación de documentación precisa, al mismo tiempo que incrementan la rapidez y la eficiencia.

Alentar la eficiencia, estandarización y documentación

En su forma más básica, el proceso de cultivo celular implica cuantificar la proliferación y la densidad de las células (conocida como confluencia) al mismo tiempo que se evalúa la morfología celular. La adaptación a una distribución del trabajo de cultivo celular que permite hacer este proceso más eficiente, preciso y estandarizado mejora la reproducibilidad y el curso de los experimentos:

• La estandarización de condiciones asegurará que las muestras sean equiparables entre los investigadores y los experimentos. Note que las células cultivadas bajo condiciones poco uniformes pueden mostrar patrones de crecimiento y expresiones genéticas alterados, lo que afectará la función celular.
• La documentación de resultados proporcionará una imagen precisa del comportamiento celular a lo largo del tiempo y favorecerá su trazabilidad para referencias futuras, auditorías, consultas entre colegas/asociados, o aplicaciones patentadas.
• La rapidez y la eficiencia mantienen la salud del cultivo, dado que se minimiza el tiempo de exposición de las células a un entorno fuera de las óptimas condiciones de incubación; una distribución del trabajo rápida también libera tiempo del científico para que pueda enfocarse en otras tareas.

El proceso de cultivo celular moderno puede sacar provecho de las mejoras aplicadas en los sistemas clásicos de cultivo celular, como el microscopio invertido, aunque también puede incorporar los avances tecnológicos que asisten en la automatización del laboratorio de cultivo celular (ver Figura 1).

Figura 1. Tecnologías que soportan un flujo de trabajo de cultivo celular optimizado

Características de instrumentación para un microscopio de cultivo celular optimizado

Al llevar a cabo cultivos celulares, el éxito se obtiene a través de una observación reveladora y una eficiente distribución del trabajo. A medida que la microscopía evoluciona, los sistemas diseñados para observar y analizar cultivos celulares han incorporado varias características de instrumentación (hardware) a fin de superar los desafíos planteados en el flujo de trabajo (ver Figura 2).

Figura 2. El microscopio de cultivo celular CKX53 (izq.) y el sistema de monitorización de incubación Provi™ CM20 de Olympus (dcha.) ofrecen funciones para racionalizar la estandarización y el control de calidad en la distribución del trabajo de cultivo celular.

Por ejemplo, las acciones ergonómicas, como el posicionamiento manual natural para el enfoque y el muestreo, incrementan la rapidez del proceso celular. Esto beneficia a los cultivos celulares, ya que se acorta el tiempo de exposición de las células a un entorno fuera de las óptimas condiciones de incubación. Un tiempo de exposición adicional a un entorno fuera de una incubadora incrementa el riesgo de contaminación y puede generar estrés en las células, lo que altera la fisiología y lleva a inconsistencias entre las muestras.

Estos sistemas también ofrecen un diseño compacto que se adapta al interior de las cabinas de seguridad biológica. La observación puede llevarse a cabo en un ambiente estéril a fin de reducir el riego de contaminación.

Observación uniforme de alto contraste para cultivos celulares

Otra mejora implantada en el flujo o la distribución del trabajo de cultivo celular es la capacidad para ejecutar observaciones con rapidez y alto contraste. La combinación de microscopios de cultivo celular con componentes ópticos avanzados proporciona una visualización clara y amplia que facilita un cribado rápido y eficiente.

Asimismo, los avances que se han realizado en los métodos de observación mejoran el procesamiento de imágenes para los cultivos celulares. Este es el caso del contraste de fase, un método de observación popular entre los citólogos (biólogos celulares). Sin embargo, la aplicación adecuada de este método requiere la preparación y centrado de cada objetivo, como también el uso de cada uno de estos objetivos con su anillo de fase apropiado. Esto puede exigir mucho tiempo y conllevar a errores si los investigadores alinean o usan de forma incorrecta los anillos de fase cuando alternan las magnificaciones.

Para hacer frente a ello, Evident ofrece la tecnología de fase de contraste integrada (iPC), la cual produce imágenes de alto contraste sin necesidad de cambiar la ranura del anillo al alternar entre los objetivos de 4X a 40X. Esta distribución del trabajo más simple incrementa la eficiencia y retira un punto potencial de inconsistencia entre los investigadores.

Versatilidad para un amplio rango de observación y tareas analíticas

Con la extensión de versatilidad del microscopio de cultivo celular, las capacidades del procesamiento de imágenes con fluorescencia permiten que los investigadores lleven a cabo observaciones de rutina y estudios de funcionamiento en el mismo sistema. Esto permite economizar espacio y costos (Esp. costes). Un solo sistema puede usarse para múltiples etapas del flujo de trabajo de cultivo celular: desde la monitorización del cultivo, pasando por la proliferación y el paso, hasta el procesamiento de imágenes de alto contraste con fluorescencia en los ensayos celulares, usando un amplio rango de tinciones.

Adquisición de imágenes simple y flexible

Una parte importante del proceso de cultivo celular es la documentación de rutina que se genera a partir del procesamiento de imágenes de las células. Muchos microscopios invertidos dedicados a cultivos tisulares poseen la flexibilidad para agregar cámaras digitales a fin de que el investigador pueda generar sus imágenes mientras trabaja.

Hasta hace poco, estas cámaras requerían ser conectadas a un PC de procesamiento de imágenes. No obstante, un PC puede quitar espacio útil en el cuarto del cultivo tisular; además, el cableado entre la cámara y el PC precisa que los dispositivos sean ubicados uno al lado del otro, lo que limita la localización de ambos instrumentos. Los modernos sistemas de cámaras vencen estos desafíos a través de opciones de procesamiento de imágenes flexibles y que ocupan poco espacio. Por ejemplo, la cámara EP50 de Olympus puede conectarse de forma inalámbrica a una serie de dispositivos: un PC, una tableta o un teléfono inteligente. Esta configuración inalámbrica también permite que el microscopio sea desplazado dentro del espacio dedicado al cultivo tisular, y ubicado en el lugar conveniente.

Aparte de una mayor flexibilidad, la cámara EP50 se dota de un sistema operativo, un software y opciones de almacenamiento bien integradas. Por consiguiente, es posible montar un monitor directamente en la cámara para crear una solución de procesamiento de imágenes «todo en uno». Esta configuración elimina por completo la necesidad de contar con un PC externo. La unidad completa también puede ser usada de forma segura dentro de una cabina de seguridad biológica, lo que permite un procesamiento de imágenes dentro de un entorno estéril.

Figura 3. Microscopio de cultivo celular CKX53 y cámara EP50

Generar datos cuantificables sobre el crecimiento celular

Una pieza esencial del éxito en el cultivo celular es la monitorización prolongada del crecimiento y la confluencia de las células. El crecimiento del cultivo celular pasa por las siguientes fases: fase de latencia, fase exponencial y fase estacionaria (ver Figura 4).

Figura 4. Crecimiento celular

La proliferación de células inicia en la fase de latencia, que cambia a la fase exponencial a medida que la concentración del factor de crecimiento incrementa. Cuando los nutrientes han sido consumidos o la densidad celular incrementa, se produce la inhibición de contacto y se detiene la proliferación celular. Escoger el momento adecuado para procesar células en proliferación es vital a fin de asegurarse de que estas hayan crecido lo suficiente para un rendimiento idóneo que no haya alcanzado aún la saturación.

Todas las etapas, desde preparar las muestras celulares para el paso, pasando por la experimentación posterior, el almacenamiento hasta el recuento celular, son cruciales por diferentes motivos:

• Paso: Las densidades uniformes de cultivo se traducen en cultivos que crecen al mismo ritmo y poseen el mismo estado de salud.
• Experimentación posterior: El recuento de células idénticas facilita la obtención de resultados comparables.
• Almacenamiento: Conocer la concentración y vitalidad celular en cada frasco es importante cuando se reanima una línea celular tras el almacenamiento.

Por lo general, las estimaciones de confluencia y recuento celular se efectúan de forma visual; pero, esto puede ser altamente variable. Si se coloca una misma placa de células frente a múltiples investigadores, es posible que se obtenga una amplia variedad de estimaciones con respecto al recuento celular y confluencia.

Coherencia en la monitorización

Si bien un microscopio convencional permite asegurar que los cultivos estén siendo evaluados de forma coherente, una monitorización regular también es igual de importante. Si las células no son examinadas los días o incluso en los momentos del día correctos, el momento idóneo para el paso u otra variación experimental puede perderse (ver Figura 5). El paso ejecutado en un momento incorrecto o incoherente puede causar problemas posteriores en los cultivos y la experimentación. Al combinar un software de cultivo celular con un sistema de monitorización de incubación para un monitoreo continuo, los investigadores podrán saber el momento exacto en que las células están aptas para el paso.

Figura 5. La monitorización constante del crecimiento celular permite llevar un proceso estandarizado.

Análisis automatizado de células usando la inteligencia artificial

Los sistemas de monitorización de incubación, como el sistema CM20, ofrecen softwares de inteligencia artificial avanzados. Los análisis por inteligencia artificial permiten a los usuarios evaluar de forma automática la salud de los cultivos celulares mediante el uso de parámetros coherentes, lo que reduce errores humanos y permite líneas celulares más precisas y reproducibles.

Además, estos parámetros de datos y análisis pueden almacenarse, usarse nuevamente y transferirse. Esto reduce el tiempo de capacitación y asegura que los diferentes usuarios que trabajan en un laboratorio sigan los mismos procedimientos para evaluar la salud de las células.

Mediante la estandarización de su flujo de trabajo a partir de la recopilación de datos cuantitativos, es posible detectar un cultivo celular anormal en una etapa temprana del proceso, lo que ahorra tiempo y reduce el uso de costosos consumibles de laboratorio en cultivos celulares inutilizables.

Cambiar el paradigma del cultivo celular con la monitorización remota

Otro avance en el flujo de trabajo de cultivo celular es la monitorización de cultivos celulares a distancia/remota. En la distribución convencional del trabajo de cultivo celular, un investigador debe estar presente para llevar adelante el proceso de monitorización de cultivos. Los sistemas de monitorización de incubación, como el sistema CM20, pueden monitorizar placas de cultivos celulares en una base continua sin necesidad de intervención por parte de un investigador. Estos dispositivos se encuentran ubicados directamente en el interior de una incubadora de cultivo celular, y proporcionan datos cuantitativos sobre los cultivos celulares a distancia (ver Figura 6).

Figura 6. El sistema de monitorización de incubación CM20 adquiere datos celulares desde la incubadora.

Mejorar la salud de las células

Los sistemas de monitorización de incubación son inherentemente idóneos para mantener la salud celular. Puesto que son colocados directamente dentro de la incubadora, las placas de cultivo celular no necesitan ser retiradas de la incubadora para poder efectuar una monitorización regular. Esto asegura el mantenimiento coherente de las células bajo óptimas condiciones y reduce el riesgo de contaminación.

Los sistemas de monitorización de incubación también pueden usar métodos de iluminación durante procesamientos de imágenes diseñados específicamente para soportar la viabilidad celular. Cabe resaltar que una exposición excesiva a los métodos de iluminación de campo claro, proporcionados por los microscopios convencionales, puede dañar las células. Para enfrentar esto, el sistema de monitorización de incubación CM20 usa un método de iluminación alternativo denominado «iluminación episcópica oblicua». La iluminación episcópica oblicua usa un LED de 630 nm para reducir la fototoxicidad, incluso bajo una observación continua.

La combinación de un sistema de monitorización de incubación con un software dedicado a cultivos celulares también permite una generación transparente de datos cuantificables relativos a las células, cuyo uso crea un registro de crecimiento preciso, sin disociaciones ni inclusiones de soluciones innecesarias para optimizar las condiciones del cultivo. Estos sistemas están diseñados para transmitir datos a distancia; por lo tanto, pueden monitorear el progreso de los cultivos en donde se encuentren.

Figura 7. Visualización de datos de cultivo celular a distancia con el sistema CM20

Rediseñar el flujo de trabajo de cultivo celular

Los cultivos celulares representan el pilar de las aplicaciones de las ciencias de la vida; y, para obtener resultados de alta calidad, también se requiere un proceso de cultivo de alta calidad. A pesar de que el campo del cultivo celular ya está bien desarrollado, existen nuevas tecnologías que presentan optimizaciones de modo incremental y significativo con el fin de asegurar resultados coherentes, eficientes y cuantificables.

Los microscopios dedicados a cultivos celulares, que se han mantenido actualizados, proporcionan hoy una ergonomía mejorada, componentes ópticos más apropiados y coherentes, como también una flexibilidad para incorporar más modalidades en el procesamiento de imágenes, como la fluorescencia.

A su vez, los sistemas de monitorización de incubación permiten adquirir datos cuantitativos continuos al mismo tiempo que se aminora el daño celular y se elimina una cantidad significativa del trabajo manual de rutina.

Estos sistemas trabajan mejor en colaboración los unos con los otros. Si bien los sistemas de monitorización de incubación sustituyen la carga de trabajo de la monitorización de rutina, un recuento preciso de células, su paso, y su evaluación con fluorescencia son aún más exitosos al ser supervisados por un investigador capacitado en el microscopio.

Mediante la creación de un nuevo flujo de trabajo que adopta tecnologías inteligentes de laboratorio, los científicos pueden crear un sistema de cultivo celular eficiente, integralmente documentado, y altamente estandarizado. Como resultado, los científicos pueden acelerar su trabajo en los experimentos de las ciencias de la vida y las aplicaciones de medicina regenerativa.

Autor

Joanna Hawryluk, Gerente de producto, Evident
Avi Smith, Gerente de producto, Evident