물고기의 나이는? - SLIDEVIEW™ VS200 연구 슬라이드 스캐너를 사용하여 물고기 이석 검사의 어려움 극복

소개

청어라고도 알려진 Clupea 종의 이 물고기는 북대서양의 해양 어업 역사에서 중요한 역할을 하였으며 20세기 초에 시작된 청어 연구는 수산 과학 발전의 기초가 되었습니다(그림 1). 이 기름진 생선은 오랜 역사 동안 중요한 식량이기도 했습니다.

청어는 대개 북태평양과 북대서양(발트해 포함)과 남아메리카의 서해안 연안의 특히 얕고 온난한 수역에서 발견되는 어초 주변과 해안 근처에서 큰 무리를 지어 이동합니다. 알려진 Clupea는 3종이며 어업을 통해 포획되는 모든 청어의 약 90%를 차지합니다.

_{그림 1. 청어.}

어류 연령 및 성장 연구는 산란기와 규모, 가입, 서식지 이용, 자어 및 치어 기간 및 개체 연령 구조를 이해하는 데 중요합니다. 결과적으로 이러한 지식은 적절한 어업 관리 정책을 설계하는 데 중요합니다. 이석의 고리 수를 세어 물고기의 나이를 알아낼 수 있습니다.

_{그림 2. 청어 이석.}

물고기의 일생 동안 어류 이석에 탄산칼슘과 끈적한 기질 층이 쌓이게 됩니다. 축적률은 물고기의 성장에 따라 달라지며 일반적으로 겨울에는 덜 성장하고 여름에는 더 많이 자라 나이테와 유사한 고리 모양이 나타납니다. 고리를 세어 물고기의 연도 단위 나이를 알 수 있습니다. 또한, 대부분의 종에서 탄산칼슘과 끈적한 기질이 하루 주기에서 교대로 축적되므로 물고기의 나이를 일 단위로도 알 수 있습니다. 이러한 정보는 현미경을 사용하여 얻어야 하며 어류의 초기 생활사 연구에 중요한 데이터를 제공합니다.

실험

연구원들은 이석을 추출하여 아크릴 수지에 넣고 약 50μm의 두께가 되도록 갈았습니다.

기존에는 편광 기능을 갖춘 수동 직립 현미경을 통해 이석을 관찰하여 일일 성장 고리를 계산하였습니다.

개별 층(고리)의 가시성은 여러 초점에 따라 변하므로 관찰자가 계속해서 이석 초점을 다시 맞춰야해서 시간이 많이 소요됩니다.

Olympus SLIDEVIEW VS200 슬라이드 스캐너를 사용해 이석 이미지 캡처를 자동화할 수 있어 상당 시간을 절약할 수 있습니다(그림 3). 이 시스템은 편광 또는 명시야에서 서로 다른 배율로 최대 31개의 평면 Z 스택을 얻도록 구성될 수 있습니다. 투과 명시야에서 전동 조리개는 대물렌즈의 조리개와 관련하여 조리개를 닫아 대비 정도를 개선하도록 조정할 수 있습니다. (그림 4A)

_{그림 3. Olympus SLIDEVIEW VS200 연구 슬라이드 스캐너.}

결과

치어 이석의 직경은 약 75μm입니다. 성체 이석의 직경은 약 1,180μm입니다. 이미지 4b는 광학적 이방성 특성으로 인해 주로 보이는 표본을 관찰하도록 설계된 편광 현미경을 사용하여 캡처되었습니다. 스캐너는 표본 앞의 광 경로에 위치한 편광판과 대물렌즈 후면 조리개와 카메라 포트 사이의 광 경로에 위치한 분석기(두 번째 편광판)에 장착되어야 합니다. 이미지 대비는 평면 편광과 복굴절(또는 이중 굴절) 표본의 상호 작용에서 발생하여 서로 수직인 평면에서 각각 편광되는 두 개의 개별 파동 구성 요소를 생성합니다.

이석의 중심으로 갈수록 고리가 바깥 부분보다 훨씬 조밀합니다. 이러한 현상은 이미지 5A 및 5B에서 명확하게 볼 수 있습니다. 이 이미지는 고리의 가시성은 여러 수준에서 변화하기 때문에 여러 Z 평면(Z 스택)에서 이미지를 인식하는 것이 중요함을 또한 보여줍니다.

VS200 시스템은 이석 이미지를 자동으로 인식하므로 수동으로 초점을 조절과 인식의 지루한 작업을 덜어줍니다. 이미지가 디지털화되기 때문에 이석층을 세고 나이를 측정하는 전자동 디지털 이미지 분석 프로그램을 만들 수 있습니다.

그림 5A. 치어 이석 Z 스택의 중앙 컷아웃. 개별 Z 평면은 Z 위치에 따라 μm 단위로 표시됩니다(왼쪽 상단에서 시작하여 오른쪽 하단까지). 각 Z 평면 사이의 거리는 1.17μm입니다. Z 스택이 20μm의 거리에 걸쳐 있으며 중앙 부분의 이석층 사이의 거리는 약 600nm에 불과합니다.

그림 5B. 성체 이석 Z 스택의 중앙 컷아웃. 개별 Z 평면은 Z 위치에 따라 μm 단위로 표시됩니다. 각 Z 평면 사이의 거리는 1.17μm입니다. Z 스택이 34μm의 거리에 걸쳐 있으며 중앙 부분에서 이석층 사이의 거리는 약 740nm입니다.

결론

SLIDEVIEW VS200 연구 슬라이드 스캐너는 수지에 묻힌 어류 이석의 이미지를 인식하는 쉽고 편리한 방법을 제공합니다. 치어의 경우 이석층 간 거리가 약 600nm에 불과하므로 고배율 및 고해상도를 지원하는 이미징 시스템이 필요합니다. 개구수가 0.95인 40배율 UPlanXApo 대물렌즈를 사용하는 VS200 시스템은 이러한 이미지 캡처에 필요한 배율과 해상도를 제공합니다.

성체 이석 표본 또한 상당히 두껍고(최대 34μm) 탄산칼슘으로 만들어지기 때문에 매우 불투명합니다. VS200 시스템은 이러한 과제를 극복하고 고품질 이미지를 얻을 수 있는 고급 기능을 제공합니다. 두꺼운 샘플의 경우 시스템에서 편광을 사용하여 여러 Z 평면에서 샘플을 스캔할 수 있습니다. 이석 샘플의 대비를 향상하기 위해 시스템의 조리개를 닫아 연령 고리가 더 잘 보이도록 하여 쉽게 개수를 셀 수 있습니다.

감사의 글

본 애플리케이션 노트는 덴마크 링비 해양생물자원과 국립수산자원연구소 Bastian Huwer 박사와의 협업을 통해 작성되었습니다