현대 생명과학 연구에서 형광 현미경은 인기 있는 강력한 이미징 기술입니다. 형광단이 표적에 명확히 표지된 상태에서 방출된 형광 신호는 분자 수준까지 최소 배경으로 최고 이미징 대비를 제공할 수 있습니다.
첨단 유전자 공학의 광범위한 표지 방법을 비롯하여 고도로 개발된 광학 기술이 생물학 연구에서 형광 현미경의 성공 요인입니다.
하지만 전반적인 성공에도 불구하고 형광 표지 또는 분자의 필요는 형광 현미경의 용도를 여전히 제한합니다.
- 많은 생체분자는 무형광이고 작으며 형광 표지에 의해 쉽게 동요됩니다
- 살아 있는 유기체 내 형광단의 발현 및 특이성은 때때로 실험 결과를 복잡하게 만듭니다
- 외인성 형광 표지의 사용은 사람에 대한 생물학적 연구에 우려를 야기합니다
이러한 제한을 감안할 때 형광 이외에 대비를 사용한 광학 이미징 방법이 요구됩니다. 이 게시물에서는 형광 현미경을 넘어 생각하고 연구 능력을 확장할 수 있도록 대체 생물학적 이미징 방법을 공유합니다.
형광 현미경을 초월한 생각
비선형 광학은 특정 분자의 내재적 속성에서 신호를 발생시켜 형광의 필요 없이 이미징 대비를 형성할 수 있습니다.
첨단 레이저 소스 및 현미경 기술의 유용성 덕분에 비선형 광학은 실험실 내의 공상적인 실험만을 위한 것이 아닙니다. 비선형 광학은 생물학적 이미징을 위한 실현 가능한 솔루션이 되었으며 형광 현미경을 넘어 생각하도록 연구원들에게 영감을 줍니다. 한 가지 좋은 예가 광학적 고조파 발생(HG) 현미경입니다.
SHG 및 THG 현미경에 대한 이해
간단히 말해서, HG는 n 광자들이 재료와 동시에 상호작용하여 하나의 광자로 변환하는 비선형 광학 프로세스입니다. 2차 고조파 발생(SHG, 2개의 광자가 1개의 광자로 변환) 및 3차 고조파 발생(THG, 3개의 광자가 1개의 광자로 변환)이 생물학적 이미징의 HG 현미경에 가장 일반적으로 사용됩니다.
SHG 및 THG에서 광자 변환 프로세스는 아래 야블론스키 다이어그램(그림 1)에 예시되어 있습니다. SHG는 광자에 이광자 에너지(반파장)를 부여하고, THG는 광자에 여기 광자의 삼광자 에너지(3분의 1 파장)를 부여합니다.
그림 1: JSHG 및 THG 광학 프로세스의 야블론스키 다이어그램. 파선은 가상 상태를 나타냅니다.
다광자 현미경과 마찬가지로, SHG와 THG는 작은 여기 초점 부피에서 비선형 광학 프로세스를 이행하기 위해 일반적으로 근적외선 파장 범위에서 초고속 펄스 레이저 소스를 필요로 합니다. 결과적으로, SHG 및 THG 현미경은 다음 특징을 가집니다.
- 내재적 광절단 기능
- 크게 산란된 조직의 심층 이미징
- 낮은 광퇴색 및 광독성
- SHG 및 THG 신호 강도는 각기 레이저 여기 파워의 제곱 및 세제곱에 비례합니다
하지만 다광자 현미경과 달리, SHG 및 THG 신호는 광학 속성과 재료의 구조에서 나옵니다.
- SHG 현미경은 콜라겐 섬유, 미소관, 근육 미오신, 녹말, 피부 조직, 각막의 스트로마 같은 비중심 대칭적 분자 및 규칙 구조의 이미징에 일반적으로 적용됩니다.
- THG 현미경은 세포기관, 적혈구 또는 백혈구, 지질 소적, 지방 조직, 축색돌기 미엘린초, 뼈 같은 높은 굴절률 물질 또는 접촉면(주위 물과 비교)의 이미징에 일반적으로 적용됩니다.
형광단의 필요 없이, SHG 및 THG 현미경은 무표지 이미징을 획득할 수 있으며 생물학적 조직, 살아 있는 유기체 뿐 아니라 진단을 위한 의료 이미징에서도 분자 및 구조 정보를 제공할 수 있습니다.
그림 2: Olympus FVMPE-RS 다광자 현미경을 사용하여 획득된 무표지 돼지 지방 조직의 SHG/THG 이미지. SHG 신호(청록색)는 콜라겐 섬유를 보여주며, THG 신호(마젠타색)는 지방 조직의 지방을 보여줍니다.
그림 3: FVMPE-RS 다광자 시스템을 사용하여 획득된 제브라피시 배아의 혈류. SHG 신호(빨간색)는 근육 섬유를 보여줍니다. THG 신호(녹색)는 적혈구를 보여줍니다. 이미지 제공: P. Engerer, 뮌헨 공과대학 Misgeld 그룹. | |
SHG 및 THG 현미경의 기본 사항을 살펴보았습니다. 다음 섹션에서는 이러한 기법을 실행할 수 있는 팁을 제공합니다.
SHG 및 THG 현미경 구성을 위한 실용적 고려 사항
SHG 및 THG 현미경은 다광자 현미경과 동일한 근적외선 레이저 소스 및 레이저 스캐닝 장치를 공유할 수 있기 때문에 FVMPE-RS 다광자 현미경은 SHG 및 THG 현미경과 쉽게 결합되어 다모드의 이미징 시스템을 형성합니다.
다음은 SHG 및 THG 현미경 설정 시 두 가지 실용적 고려 사항입니다.
- 순방향 검출 및 고감도 검출기:
형광 방출이 일반적으로 등방성이지만, SHG 및 THG 신호는 파장 혼합 프로세스에서 기인하는 특정 방향성을 가집니다. 대부분의 샘플에서 순방향 신호(대물렌즈로부터 떨어져 있음)는 역방향 신호(대물렌즈로 향함)보다 훨씬 더 강합니다. 이 경우 개구수가 높은 콘덴서 및 NDD(transmitted non-descanned detector)는 순방향 신호 검출의 좋은 선택입니다. 크게 산란된 조직에서 일부 순방향 신호는 역방향 신호 검출에 의해 후방 산란되고 검출될 수 있습니다. 이 경우 특히 순방향 신호 검출이 벌크 샘플이나 살아 있는 동물에 적용되지 않을 때 갈륨 비소 인화물 광전자 배증관(GaAsP PMT) 같은 고감도 NDD를 사용하여 역방향 검출 효율을 최적화합니다.
- 더 긴 파장에서 양질의 레이저 파워:
THG 신호는 비선형 광학 프로세스를 이행하기 위해 양질의 레이저 여기 파워를 필요로 하며 여기 파장의 3분의 1에서 발생됩니다. THG 현미경의 신호 전송 및 검출 향상을 위해 THG 신호가 가시 광선 범위 내에 해당될 수 있도록 1200nm보다 더 긴 파장에서 양질의 레이저 소스 파워를 사용합니다. 과거에는 1200nm 이상의 레이저 소스를 생성하는 데 근적외선 레이저, 광파라메트릭 발진기(OPO) 및 전문적으로 훈련된 작업자가 필요하였습니다. 레이저 기술이 크게 발전한 현재는 Spectra-Physics InSight® X3 같은 턴키 방식의 초고속 펄스 레이저로부터 긴 파장에서 엄청난 레이저 파워를 생성할 수 있습니다.
형광 현미경을 넘어 연구 역량 확대
첨단 현미경 및 레이저 기술이 장착된 FVMPE-RS 다광자 이미징 시스템은 하나의 다모드 이미징 플랫폼에서 다광자, SHG 및 THG 현미경을 모두 가질 기회를 제공합니다. 이러한 강력한 역량을 기반으로 형광 현미경을 넘어 연구 역량을 확대할 수 있습니다.
