FLUOVIEW FV4000 레이저 컨포컬 현미경을 위한 차세대 SilVIR 검출기 시스템 새로운 내용

요약

Evident는 FV4000 레이저 컨포컬 현미경을 위한 독자적인 차세대 SilVIR 검출기 시스템을 개척해 왔습니다. 이 검출기는 탁월한 신호 대 잡음비(S/N)로 매우 낮은 수준의 잡음과 높은 감도를 구현하며 가시광선부터 근적외선 파장까지 다색 이미징 분야에서 새로운 벤치마크가 되었습니다. 고속 및 하이 다이내믹 레인지 광자 계수 등 정확하게 광자를 검출할 수 있는 기능을 갖춘 SilVIR 검출기는 실험에서 반복성을 실현하는 데 도움이 됩니다. 또한 이 검출기는 PMT 검출기에 일반적으로 필요한 게인 조정이 필요하지 않으므로 작동 경험이 간소화됩니다. 탁월한 성능을 제공하는 이 SilVIR 검출기는 업계에서 레이저 스캐닝 현미경의 새로운 기준을 세웠습니다.
 

1. 서론

여러 광자 수준에서 높은 감도와 높은 게인으로 약한 빛을 검출할 수 있는 광전자 증배관(PMT)은 매우 약한 형광을 포착하는 레이저 스캐닝 현미경(LSM)을 위한 표준 검출기였습니다. 그러나 PMT 사용 시 LSM과 관련된 많은 문제점이 있었습니다. 이러한 문제점은 다음 섹션에서 논의하겠습니다.

SilVIR 검출기 시스템은 반도체형 센서를 사용하여 형광을 검출합니다. 이 실리콘 광전자 증배관(SiPM)으로 기존 PMT의 문제와 제약 중 다수를 해결할 수 있습니다. 신호 처리 회로는 또한 센서의 기능을 극대화하는 기술을 활용하여 센서의 응용 분야를 높은 픽셀 수의 고속 이미징으로 확대합니다(그림 1).

이 글에서는 PMT를 사용하는 기존 LSM 이미징의 문제와 SilVIR 겸출기가 이러한 문제를 어떻게 해결하는지를 설명합니다.

_{그림 1. SilVIR 검출기를 구성하는 장치: (a) FV4000 형광 검출기, (b) SilVIR 검출기의 스펙트럼 감도를 보여주는 그래프—이 검출기는 광대역 유형 및 적색 전환 유형을 사용하여 400nm에서 900nm까지 기존 고감도 GaAsP-PMT보다 더 높은 감도를 제공함 (c) SilVIR 검출기는 SiPM 센서, 1GHz A/D 샘플링 및 디지털 신호 처리로 구성됨.}
 

2. 레이저 스캐닝 현미경 검사자의 요구 사항—더 나은 검출기  

LSM 사용자가 흔히 말하는 불만 사항은 다음과 같습니다.

• 장치 성능 극대화를 위해 어느 설정을 조정해야 하는지 혼동됨
• 과다한 광표백 및 광독성
• 의도하지 않은 검출기의 포화
• 이미지 품질, 해상도, 프레임 속도 향상의 필요성
• 더 나은 이미지를 얻을 수 없음

이러한 불만 사항의 근본 원인은 PMT 검출기와 검출기의 주요 작동 원리입니다. Evident가 보다 진화한 검출기를 구현할 때 고려한 요인들은 다음과 같습니다.

높은 감도 및 신호 대 잡음비(S/N)

약한 형광 신호로 이미징을 수행할 때와 마찬가지로 소량의 입사 광자를 효율적으로 검출하려면 검출기의 양자 효율(QE)과 광자 검출 효율(PDE)이 높아야 합니다. 또한 높은 신호 대 잡음비(S/N)를 달성하기 위해 센서 및 검출기 회로의 내재적 잡음이 미미해야 합니다.

검출된 빛 정량화

검출된 빛을 물리적으로 측정하는 방법에 대한 정의는 다양하지만 “광자 수” 정량화가 매우 약한 형광을 가장 정확하게 정량화하는 방법입니다. 따라서 강도를 측정하는 가장 단순한 방법은 검출된 광자 수를 측정하는 것입니다(그림 2).

수치를 사용하여 형광 강도를 정량화하는 것이 매우 중요합니다. 예를 들면, 이러한 수치는 장치별로 달라지지 않으므로 여러 기기에서 동일한 이미징 결과를 재현할 수 있습니다. 또한, 광자 수는 보편적인 값이므로 연구자는 더 쉽게 서로 데이터를 공유할 수 있습니다. 마지막으로 정량적 값은 분석 도중 처리 전 이미지의 지표로 사용할 수 있습니다.

_{그림 2. 형광 검출 프로세스는 광자가 광센서의 표면에 입사되면서 시작됩니다. 검출된 광자는 전자로 변환되고 증폭된 후 전류로 출력됩니다. 이 전류는 증폭 회로를 통과한 후 아날로그-디지털 변환 과정을 거칩니다. 그 다음, 디지털화된 신호가 산술적 처리에 의해 각 픽셀에 대한 강도 값으로 전환되고 소프트웨어는 이미지에서 각 픽셀로 이러한 신호를 시각화합니다.}

높은 다이내믹 레인지

위에서 설명한 작업이 실행되더라도 한 번에 검출 가능한 최대 광자 수(이를 다이내믹 레인지라고 부름)가 적으면, 형광 강도가 강한 영역에서 강도 포화가 발생하고 정량성이 손실됩니다. 또한, 이미지 품질을 향상하는 방법 중 하나는 강한 여기로 방출 광자를 증가시켜 광자 잡음(센서에서 광자 검출 시 발생하는 확률적 잡음, 산탄 잡음(shot noise)이라고도 부름)을 억제하는 것입니다. 다이내믹 레인지가 높으면 밝기를 포화시키지 않고 고품질 이미지를 얻을 수 있습니다. 예를 들면, 그림 3에서 볼 수 있듯이 오른쪽의 여기가 강해질수록 더 많은 형광이 검출되어 이미지 품질이 향상됩니다. 그러나 궁극적으로 검출기 포화로 인해 많은 후 처리 및 분석 단계가 위험에 처할 수 있습니다.

이미지 정량화를 위한 일관적인 검출기 게인

검출기 또는 회로의 조건을 변경하지 않고 하이 다이내믹 레인지를 달성하는 것이 이상적입니다. 예를 들면, 검출기 게인이 변경되어 상위 범위가 확장되면 그 결과 얻어지는 이미지의 강도 또한 변경됩니다. 그러나 이러한 관계는 선형적이지 않으므로 이미지만으로 검출된 빛의 양을 반비례 관계로 추정하기 어렵습니다. 교정을 위해 보정 곡선을 별도로 준비해야 합니다. 반면, 그림 3의 라인 차트 플롯은 각 이미지에서 라인 A에 걸쳐 밝기 프로파일을 보여줍니다. 이러한 이미지가 고정된 검출기 설정으로 획득되는 경우, 각 픽셀에서 검출된 광자 수는 이미지의 강도로 정량적으로 추정할 수 있습니다.

_{그림 3. 형광 강도와 이미지 품질의 관계. 신호 대 잡음비는 형광 강도/√형광 강도로 결정됩니다.}
 

3. LSM 이미징 시 기존 PMT 검출기가 제시하는 문제

레이저 스캐닝 현미경에 PMT 검출기를 사용할 경우 발생하는 주요 문제는 아래와 같습니다.

높은 감도와 높은 신호 대 잡음비를 모두 달성하기 어려움

현재, 흔히 GaAsP 광전 음극형 PMT[1]가 고감도 검출기로 사용됩니다. PMT의 가시광선 범위 QE는 40% 이상으로 향상되었습니다. 센서와 회로의 잡음 때문에 PMT를 사용할 때는 일반적으로 상대적 잡음이 이미지에 영향을 미치지 않도록 더 높은 게인으로 신호를 증폭했습니다. 또한, PMT는 광자를 수광 표면에서 전자로 변환합니다. 그 다음 전자는 확률적 다단계 증폭 프로세스를 걸쳐 전류 신호를 생성합니다(그림 4). 그러므로 검출된 광자의 수가 일정해도 확률적 변동 때문에 출력이 매번 변경됩니다. 이 때문에 특히 검출된 광자 수가 적은 고픽셀, 고속 이미징의 경우 이미지의 신호 대 잡음비를 낮출 수 있습니다.

_{그림 4. PMT의 입력-출력 특징의 구조. 광자가 광전 음극에 입사되면 광전 음극에서 방출된 전자가 진광관에서 증폭됩니다. 2차 전자가 반복적으로 여러 다이노드 체인에서 증폭됨에 따라 하나의 광자를 검출할 때 출력 펄스 신호가 균등하거나 안정적이지 않게 됩니다.}

검출된 광자 강도의 낮은 정량성

위에서 설명한 대로 PMT는 광전자가 증폭되는 동안 확률적 변화를 보입니다. 따라서, 특히 광자-검출 비율이 낮을 때 입력/출력 정량성이 낮습니다. 또한, 전극 사이에 적용되는 전압을 변경하여 게인을 조정할 수 있지만, 이에 상응하는 입력 및 출력 비율도 변경됩니다. 이뿐만 아니라, 동일한 전압이 적용되는 경우에도 개별적 차이 때문에 각 PMT 사이의 실제 게인은 크게 달라집니다. 적용된 전압이 특정 빛의 양을 증폭하기 위해 낮은 수준으로 설정된 경우, 적용된 전압으로 인한 게인의 변화가 적어져 선형성이 약화됩니다. [1]

그리고, 다음과 같은 피할 수 없는 현상 때문에 사용을 통해 축적된 검출 광자에 따라 PMT의 감도가 악화됩니다.

• 광자가 광전 음극에 들어갈 때, 전자는 외부 광전 효과 때문에 광전 음극에서 방출되어 진공관으로 들어갑니다. 전자가 충분히 보충되지 않으므로 광전 음극은 약화됩니다.
• 광전 음극에서 방출된 전자(광전자)와의 충돌로 인한 다이노드의 약화
• 광전자가 진공관의 잔여 가스 또는 불순물과 충돌하여 생성되는 이온과의 충돌로 인한 광전 음극 또는 다이노드의 약화
• 광전자와 다이노드의 충돌로 인해 다이노드에서 생성된 불순물로 인한 진공 감소

위와 같은 이유 때문에 PMT를 사용하는 LSM은 검출된 빛의 양과 이미지 강도 사이의 정량성을 달성하지 못합니다.

하이 다이내믹 레인지와 높은 신호 대 잡음비를 모두 달성하기 어려움

센서 게인이 증가되면, 잡음이 있어도 몇몇 광자의 약한 신호를 여전히 검출할 수 있으므로 높은 신호 대 잡음비를 달성할 수 있습니다. PMT의 출력 전류 상한은 몇 μA만큼 낮습니다. 게인이 높게 설정된 경우, 검출 광자의 수가 적어도 출력이 쉽게 포화되므로 다이내믹 레인지가 작아집니다(그림 5a). 반면, 게인이 낮을 경우, 강한 형광(많은 수의 광자)이 검출되는 경우에도 출력 신호가 포화되지 않아 다이내믹 레인지가 높아집니다. 그러나 광자가 몇 개밖에 없는 경우와 같이 약한 형광은 증폭되지 않고 잡음에 묻혀 신호 대 잡음비를 약화시킵니다(그림 5b). 그 결과, 사용자는 객체의 밝기와 필요한 이미지 품질 수준에 따라 검출기의 게인을 수동으로 조정해야 합니다. 또한, 이러한 조정으로 인해 다이내믹 레인지와 신호 대 잡음비가 의도하지 않게 변경된다는 점도 단점입니다.

_{그림 5. PMT의 게인을 조정하려면 신호 대 잡음비와 다이내믹 레인지의 균형을 맞추어야 합니다. (a) 높은 게인—하나의 광자를 검출할 때 출력 신호가 잡음보다 높게 증폭될 수 있지만 다이내믹 레인지를 감소시키며 쉽게 포화됩니다. (b) 낮은 게인-몇 개의 광자를 검출할 때 출력 신호를 잡음과 구분할 수 없습니다. 반면, 다이내믹 레인지가 더 높아지면 많은 수의 광자를 검출할 때 포화되지 않습니다.}

복잡한 검출 설정

밝기 포화를 방지하면서 만족스러운 이미지 품질을 획득하도록 검출기 설정을 조정하는 일은 복잡하기 때문에 LSM에 능숙하지 않은 사용자가 설정하기 어렵습니다. 그림 6은 설명을 위해 여러 검출기 게인 설정으로 인한 여러 가지 형광 강도의 형광 비드를 보여줍니다.

그림 6a는 높은 게인으로 획득된 여러 여기가 적용된 비드를 보여줍니다. 어두운 비드는 여기가 약해도 잡음과 거의 구분할 수 없지만(그림에서 가장 왼쪽에 있는 이미지), 밝은 비드는 여기 빛이 증가하면 포화됩니다(그림 오른쪽의 밝은 비드 부분 두 개).

반면, 그림 6b는 낮은 게인으로 획득된 동일한 형광 비드 이미지를 보여줍니다. 약한 여기가 적용된 어두운 비드(다이어그램 왼쪽에 있는 두 개)의 신호는 잡음에 묻힙니다. 여기가 최고 수준으로 설정된 경우에도 밝은 비드가 포화되지 않았으므로 이것은 높은 게인보다 우수합니다(다이어그램의 가장 오른쪽). 그러나 어두운 비드의 신호 대 잡음비에 중점을 둘 경우 그림 6a의 가장 오른쪽 이미지(높은 게인으로 캡처된 이미지)보다 더 나은 신호 대 잡음비를 달성하지 않았습니다.

세포 표본의 일반적인 형광 이미지는 영역별로 밝기가 상당히 다르며, Z 스택 이미지의 타임랩스는 스택 전반의 밝기에 훨씬 더 큰 차이를 유발할 수 있습니다. 경험이 풍부한 사용자도 밝은 영역을 포화시키지 않고 어두운 영역에서 만족스러운 신호 대 잡음비를 달성하며 이미지를 얻을 수 있는 최적의 검출기 설정을 결정하기 어렵습니다. 많은 사용자가 시행착오를 거쳐 검출기 게인, 여기 빛 강도, 노출 시간 등을 조정하므로 현미경 검사자는 실패한 이미지를 많이 만들게 될 수 있습니다.

포화를 유발하지 않는 검출기 설정으로 인해 신호 대 잡음비가 불충분할 경우, 여러 프레임을 캡처하고 이들을 평균화하거나 축적하여 무작위 잡음만 억제함으로써 신호 대 잡음비를 향상할 수 있습니다. 이 경우, 많은 프레임을 캡처해야 하므로 실제 이미징 프레임 속도가 상당히 떨어지게 됩니다.

위에서 설명했듯이, PMT를 사용하는 기존 LSM은 검출기 게인, 여기 빛 강도, 노출 시간뿐만 아니라 프레임 간 시간 평균화 회수와 같은 복잡한 이미징 매개변수를 조정해야 합니다.

_{그림 6. PMT의 게인을 조정하려면 신호 대 잡음비와 다이내믹 레인지의 균형을 맞추어야 하며, 이러한 작업은 어려울 수 있습니다. 이 이미지들은 다양한 여기 레이저 설정으로 획득했습니다. 오른쪽의 이미지는 높은 설정을 사용하여 획득했습니다. 이미지 아래의 플롯은 라인 A를 따라 강도 프로파일을 보여줍니다. 신호 대 잡음비는 S(프로파일 높이) 및 Ns(광자 잡음) 그리고 Nd(회로 잡음)의 비율입니다. 그림 6a는 높은 게인으로 획득한 샘플을 보여줍니다. 어두운 비드는 신호 대 잡음비가 더 높지만 밝은 비드는 포화됩니다. 그림 6b 는 낮은 게인으로 획득한 샘플을 보여줍니다. 어두운 비드는 신호 대 잡음비가 더 낮지만 밝은 비드는 포화되지 않습니다.}

검출 회로 문제

센서뿐만 아니라 검출 회로에도 문제가 있습니다. 센서 신호와 증폭 회로에 잡음이 있으므로 아날로그-디지털(AD) 컨버터에 의해 샘플링된 원시 신호가 픽셀 데이터로 처리될 때 신호 대 잡음비가 매우 낮아집니다(그림 7a, 왼쪽). 일반적으로, 신호 대 잡음비는 아날로그 검출 회로에서 저역 필터 또는 통합기로 평탄화한 후 신호를 샘플링하여 형광 강도의 실제 값과 같도록 개선할 수 있습니다(그림 7a, 오른쪽). 그러나 공진 스캐너처럼 스캔 속도가 빠를수록 표본 구조를 횡단하는 데 짧은 시간이 걸립니다. 그림 7b는 Figure 7a와 비교 시 두 배의 속도로 스캔되었다는 점을 제외하고 그림 7a에 제시된 것과 동일한 구조의 형광 이미지를 보여줍니다. 잡음 감소를 위한 저역 필터가 같은 방식으로 적용되면 높은 공간 주파수로 미세 구조를 처리하는 시간 분해능이 불충분해지고 결과로 얻어진 이미지의 공간 분해능이 저하됩니다(그림 7b, 오른쪽).

저역 필터의 컷오프 주파수가 증가되면 시간 분해능이 개선됩니다. 그러나 잡음 억제 효과성은 저하되고 신호 대 잡음비가 악화됩니다. 저역 필터의 컷오프 주파수가 증가되어도 신호 대 잡음비의 저하를 방지하려면, AD 컨버터의 샘플링 레이트를 픽셀 클럭의 몇 배에서 수십 배로 높여 하나의 픽셀 내에서 다수의 샘플링을 수행해야 합니다(오버샘플링). 또한, 스캔 속도가 빠르고 픽셀 수가 높을수록 한 픽셀의 드웰 시간이 짧아집니다. 이러한 이유로 AD 컨버터의 샘플링 속도가 빨라야 합니다.

잡음 평탄화의 경우 또 다른 문제는 아날로그 회로가 시간 분해능을 포기해야 저역 필터와 같은 단순한 필터를 채택할 수 있다는 것입니다. 고속으로 샘플링된 데이터에 고급 디지털 신호 처리 필터를 적용하여 시간 분해능을 희생하지 않고 잡음만 구분하는 필터 방법이 바람직합니다.

_{그림 7. 잡음 감소가 이미지 품질 및 공간 분해능에 끼치는 영향. 그림 7a는 표준 스캔 속도로 캡처되었으며, 잡음을 감소시켜 이미지 품질을 향상했습니다. 그림 7b는 7(a)보다 두 배 더 빠른 스캔 속도로 캡처되었으며, 신호 대역폭 저하로 인해 공간 분해능이 저하된 것을 볼 수 있습니다.}

위와 같이 PMT으로 LSM 수행 시 유발되는 문제는 Evident의 SilVIR 검출기로 해결할 수 있습니다. 이 검출기는 고속 디지털 샘플링을 활용하는 새로운 반도체형 SiPM 센서를 사용합니다. 다음 섹션에서는 Evident의 고급 기술을 활용하여 이러한 문제를 어떻게 해결했는지에 대해 설명합니다.
 

4. SilVIR 검출기 기술 소개

4-1. SiPM의 특징

SilVIR 검출기의 핵심 요소인 SiPM 센서는 가이거 모드 애벌란치 포토다이오드(APD, 단일 광자 계수 애벌란치 포토다이오드(SPAD)) 수천 개로 구성된 2차원 어레이로 구성되어 있습니다. 검출된 신호는 모든 APD의 합계로 출력됩니다[2](그림 8).

가이거 모드에서는 높은 게인에도 불구하고 매우 안정적인 곱셈 프로세스를 통해 높은 신호 수준에서 하나의 광자 입사가 검출됩니다. 또한, 반도체 제조 프로세스 덕분에 SiPM의 개별적 변화를 정밀하게 통제할 수 있습니다. 일관적인 대량 생산을 통해 SiPM 간 광자 검출 효율(PDE) 및 게인의 차이를 높은 수준으로 최소화할 수 있습니다. 또한, 많은 광자가 동시에 입사되더라도 해당 APD 커런트의 합계가 SiPM에서 출력되므로 출력 커런트의 상한이 높아지고 다이내믹 레인지가 넓어져 많은 수의 입사 광자를 검출할 수 있습니다. 다시 말해, 하나의 광자 신호는 높은 게인으로 배가될 수 있으며 검출 범위가 넓습니다. 그래서 높은 신호 대 잡음비와 넓은 다이내믹 레인지를 동시에 달성할 수 있으므로 게인을 조정하여 이 두 가지 중 하나를 포기해야 할 필요가 없습니다.

또한 포토다이오드와 같은 SiPM에 의한 광전기 변환은 전자가 가전자대에서 도체로 여기되는 내부 광전 효과를 활용합니다. 따라서 여기될 때 전자가 신속하게 보충됩니다. 그 결과, 대량의 입사 광이 있는 경우에도 감도와 게인이 저하되지 않습니다.

_{그림 8. 실리콘 광전자 증배관(SiPM) 센서의 구조 및 입력-출력 특징. 그림 8(a)는 SiPM이 멀티픽셀 APD로 구성되어 있음을 보여줍니다. 하나의 광자가 APD의 광자 수신 표면에 입사되면, 커런트 신호가 내부 광전기 변환에 의해 출력된 후 애벌란치 레이어에서 애벌란치 전자 증폭이 일어납니다. 그림 8(b)는 여러 광자가 동시에 입사될 때 출력 신호는 APD 신호의 합계라는 점을 보여줍니다. 검출된 광자로 인한 APD의 출력 파형은 일정하고 안정적입니다.}

또한 SiPM 센서는 탁월한 감도가 특징입니다. 그림 1b는 SiPM 센서의 스펙트럼 감도를 보여줍니다. Evident가 광대역 실리콘 검출기(BSD) 및 적색 전환 실리콘 검출기(RSD)라고 부르는 여러 스펙트럼 감도의 SiPM 센서를 함께 사용하면 가시광선(400nm)부터 근적외선(900nm) 파장 범위에서 GaAsP-PMT 검출기보다 더 나은 감도를 달성할 수 있습니다. SiPM의 광자 검출 효율(PDE)은 다음 공식으로 정의됩니다.

PDE = QE × FF × AP

QE: 양자 효율(Quantum efficiency)
FF: 조리개 효율(충전율)
AP: 가이거 모드의 확률(애벌란치 효율)

FF는 APD 픽셀 사이의 데드 존 영역과 비교 시 SiPM 광자 수신 표면의 APD 영역으로 결정됩니다. AP는 SiPM에 적용된 전압에 따라 결정됩니다. 전압이 높을수록 달성 가능한 PDE가 높아집니다. 반면, 적용 전압을 높이면 센서의 잡음도 증가됩니다. 예를 들면, Hamamatsu Photonics가 만든 S13360-3050 모델의 경우 과전압(항복 전압을 초과하여 적용된 전압)을 3V에서 7V로 증가시켜 PDE를 약 1.4배 증가시킬 수 있지만, 다크 카운트 잡음이 약 2배, 크로스토크 잡음이 2배 이상 그리고 애프터 펄스 잡음이 3배 이상 증가됩니다 [2]. 이렇게 증가된 잡음은 증가된 PDE의 장점을 상쇄하며, 결과적으로 신호 대 잡음비가 향상되지 않습니다. 또한, 증가된 잡음은 SiPM의 주된 장점 중 하나인 광자 검출의 정량성을 크게 저해합니다. 또한, 게인에 2 이상의 계수로 증가되므로 검출 다이내믹 레인지가 작아집니다. PDE 또는 QE 값만을 높이려고 하는 경우 부딪힐 수 있는 함정에 대한 예는 이러한 특징만을 맹목적으로 추구하지 않도록 경각심을 일깨워줍니다. 그럴 경우 의도하지 않은 단점을 유발할 수 있습니다. 이러한 이유로, FV4000 컨포컬 현미경은 형광 검출을 위해 과전압이 최적화된 SiPM을 사용하여 잡음 수준과 감도 간의 균형을 유지하며 탁월한 다이내믹 레인지를 구현합니다.

SiPM의 다크 카운트 잡음이 PMT보다 높다는 사실은 종종 단점으로 언급됩니다. 이에 대한 대책으로 광자 수신 표면은 다크 카운트 잡음을 초당 몇 킬로카운트에서 수십 킬로카운트로 줄이기 위해 약 -20°C(-4°F)로 냉각됩니다. 그러나 그래도 여전히 냉각된 PMT보다 SiPM의 다크 카운트 잡음이 더 큽니다. 그러나 초당 다크 카운트 잡음이 10킬로카운트인 SiPM을 2µs/픽셀 드웰 시간에서 512픽셀/라인으로 스캔하는 데 사용할 경우 1 광자에 해당하는 다크 카운트 잡음은 라인 1개당 약 10개의 픽셀에서만 나타납니다. 이 정도의 양은 LSM의 이미지 품질에 거의 영향을 끼치지 않습니다.

LSM 검출기로 SiPM을 사용할 경우 또 다른 단점은 롱 테일 감쇠가 출력 신호에 남을 수 있다는 점입니다(그림 8). 이러한 단점은 고속 이미징에서 문제를 유발하지만, 다음 섹션에서 설명된 대로 Evident는 혁신적인 검출 회로 해결책을 구현하여 이 문제를 성공적으로 해결했습니다.

4-2. 고속 샘플링 및 디지털 처리 기능

위에서 설명한 대로, 기존 시스템은 픽셀 해상도를 위해 아날로그 회로 필터링을 사용하는 신호 평탄화와 픽셀 해상도를 위한 최소의 필요 AD 샘플링 주파수(픽셀 주기의 약 1/2인 샘플링 주기)를 결합하여 신호 대 잡음비와 시간 분해능의 균형을 유지했습니다. 그러나 이러한 해결책은 고속 스캐너의 높은 픽셀 수(짧은 픽셀 주기)에 대응하기에는 기술적으로 제약이 있었습니다(그림 9a).

고속 AD 샘플링

Evident는 1GHz AD 샘플링 레이트를 실현했습니다. 이는 기존 샘플링 레이트보다 12개 더 빠른 것입니다. 그리고, Evident는 대량의 샘플링을 하나의 픽셀 주기로 수행하는 오버샘플링 방법을 채택했습니다. SiPM 센서 출력의 다이내믹 레인지가 넓으므로, 출력 신호의 범위 또한 PMT에 비해 매우 큽니다. AD 샘플링 레이트가 더 높을 뿐만 아니라 진폭-해상 정확성도 기존 장치보다 16배 더 높습니다(10비트 ~ 14비트). 이러한 고성능 장치는 SiPM 신호 처리 응용 분야에 최적화되어 있습니다. 잡음 격리는 아날로그-회로 필터 대신 디지털-신호-처리 필터를 사용합니다. 이 필터는 신호 대 잡음비를 높이기 위해 신호 대역폭을 최소한으로 희생하면서 효율적으로 잡음을 감쇠시킵니다. 그 결과, 공진 스캐너의 픽셀 수가 1k 이상인 경우에도 기존 방법으로는 분리할 수 없었던 고주파 구성 요소를 별도로 검출하고 충분한 픽셀 해상도(시간 분해능)를 달성할 수 있습니다(그림 9b).

_{그림 9. 잡음 감소 향상이 이미지 품질 및 공간 분해능에 끼치는 영향. 그림 9(a)는 아날로그 회로 필터와 저속 샘플링을 사용하는 기존 방법을 보여줍니다. 기존 방법에서는 스캔 속도가 빠를 경우 신호 대역폭 저하로 인해 공간 분해능이 저하됩니다. 그림 9(b)는 공간 분해능을 유지하면서 고속 스캔 동안 고속 샘플링과 디지털-필터 지원 잡음 감소를 함께 달성하는 것을 보여줍니다.}

신호 감쇠를 제거하기 위한 필드 프로그램 가능 게이트 어레이에서의 실시간 역변환

또한, Evident는 제약 없이 필드 프로그램 가능 게이트 어레이(FPGA)에서의 고급 신호 처리를 활용하여 느린 신호 감쇠로 인한 대역폭 저하 복원을 위한 기술을 개발했습니다. 이러한 대역폭 저하는 SiPM 센서의 단점입니다. 감쇠 신호 제거를 위한 기법으로 알려진 강제 재설정 방법이 있습니다 [3]. 그러나 Evident의 기법을 사용하면 기존 기법에 필요한 복잡한 검출 회로 없이 고속으로 출력 신호를 복원할 수 있습니다.

SiPM 센서는 광자 검출 타이밍 및 검출된 광자의 수를 정확하고 신속하게 출력할 수 있지만 한 가지 단점이 있습니다. 바로, 느리게 감쇠되는 출력 신호입니다. 공진 스캐너를 사용하여 이미징할 때 짧은 픽셀 드웰 시간으로 인해 감쇠 신호가 주변 픽셀로 누출되어 픽셀 해상도와 시간 분해능을 떨어뜨립니다(그림 10a).

SiPM를 사용하면 총 신호 출력은 각 APD의 신호 출력의 합계이고, 각 APD의 광자 입사로 인해 생성된 출력 응답 펄스 파형은 매우 안정적이고 PMT에 비해 일정한 형태를 유지합니다. 입력에 대한 응답을 고유하게 정의할 수 있다면, 최종 출력은 입력에 대한 응답의 컨볼루션 합으로 얻을 수 있습니다. 광자 검출 타이밍과 수가 그림 10b에서 x(t)이고 센서 응답이 h(t)이라고 가정하면, 출력 y(t)는 다음과 같습니다.

y(t)=(x*h)(t)=∑x(i)h(t-i)

감쇠 신호를 포함한 SiPM 출력 신호 y(t)가 측정될 때, 센서 응답 h(t)를 정의할 수 있으면, 감쇠 신호가 없는 광자 검출 이벤트 x(t)를 이 역변환을 실행하여 계산할 수 있습니다. 이러한 계산은 디컨볼루션 필터와 동일한 개념에 기초합니다 [4]. 이 필터는 신호 파형의 테일을 제거하기 위해 적용되는 경우가 많습니다. 예를 들면, 신경과학 분야에서 동적으로 변하는 칼슘 이온의 스파크 신호를 정량적으로 분석하는 경우가 있습니다. FPGA는 장치 내 역변환 계산의 실시간 처리를 가능하게 하는 고속의 고급 디지털 신호 프로세서(DSP)를 사용합니다. Evident는 그림 10c에서 볼 수 있듯이 실시간으로 FPGA에서 역변환된 센서-신호의 출력 데이터를 얻는 기법을 개발했습니다[5].

그림 10a에서 볼 수 있듯이 역변환된 데이터 시퀀스를 사용하여 픽셀 강도를 계산함으로써, 감쇠 신호가 주변 픽셀로 누출되는 것을 방지했습니다. 또한, 복원 필터는 감쇠 신호를 제거할 뿐만 아니라 원래 광자-검출 응답과 다른 혼합 잡음을 격리합니다. 이를 통해 신호의 신호 대 잡음비를 더욱 향상할 수 있습니다.

_{그림 10. SiPM의 감쇠 신호로 인한 대역폭 저하 복원을 위한 기법 개요. 그림 10(a)는 센서 감쇠 신호와 공간 분해능 저하를 보여줍니다. 10(b)는 SiPM 센서의 관계 입력 및 출력을 보여줍니다. 10(c)는 디콘볼루션에 의한 입력 신호 계산을 보여줍니다.}

그림 11에서 볼 수 있듯이, 역변환이 없는 경우 이미지 픽셀 해상도는 SiPM 신호 감쇠의 영향 때문에 저하됩니다. 특히, 고속, 고분해능 공진 스캐닝 동안 그러합니다. 반면, 역변환을 적용하면 광자 입력을 잃지 않고 시간 분해능을 복원할 수 있으므로 공간 분해능 및/또는 검출된 광자 손실 없이 고해상도 공진 스캐너 이미지(1024픽셀/라인)를 얻을 수 있습니다.

하이 다이내믹 레인지 광자 계수

원시 SiPM 출력 신호는 신호 감쇠 전 광자 검출 증가와 같이 고주파 광자-검출 이벤트가 발생할 때 쌓이기 쉽습니다(그림 11의 파란색 선). 따라서 SiPM의 하이 다이내믹 레인지를 활용하려면 AD 컨버터의 변환 범위가 파일업 효과를 포함하여 고주파 광자 검출의 신호 진폭보다 커야 합니다. 반면, 역변환 프로세스를 정확하게 수행하려면 가장 작은 신호인 한 광자의 신호 진폭을 미세 분해능 피치로 검출해야 합니다. 그러므로 미세한 분해능의 작은 진폭과 큰 파일업 진폭을 캡처하려면 고분해능 AD 컨버터가 필요합니다. 또한 역변환은 매우 높은 시간 분해능 없이, 즉 빠른 샘플링 레이트에서 많은 디지털 데이터 시퀀스를 획득하지 않고는 가능하지 않습니다. 일반적으로 고속 장치를 위해 1GHz 샘플 레이트를 갖춘 AD 컨버터는 8비트 분해능을 달성합니다. 그러나 Evident는 1GHz 샘플 레이트, 14비트 분해능(16384 그라데이션)을 갖춘 고급 AD 컨버터를 사용하여 이러한 역변환 프로세스를 달성했으며, 고급 FPGA를 사용하는 이러한 컨버터로부터 고속 대용량 처리, 고속 디지털 데이터를 달성했습니다.

역변환된 신호(그림 11의 주황색 선)가 복원되어 감쇠 신호를 제거함으로서 시간 분해능을 유지합니다. 파일업된 신호를 평등화하여 검출된 광자 수에 상응하는 펄스-출력 진폭(파장 최고 값)을 얻을 수 있습니다. 다시 말해, 하나의 광자가 검출될 때 동일한 진폭의 펄스가 출력됩니다. 이와 유사하게, 두 개의 광자가 동시에 검출될 때 두 배로 높은 진폭의 펄스가 출력됩니다. 그 후 여러 광자가 동시에 검출되면 출력되는 펄스의 진폭은 하나의 광자의 정수 배수로 증가합니다. 그러므로 특정 시간 구간 내에 N개의 광자가 검출되면 이러한 출력 펄스의 시간 적분은 하나의 광자 검출 시 펄스의 N배에 해당하는 적분 강도로 얻어집니다. 이러한 관계는 매우 짧은 시간 안에 많은 수의 광자가 검출된 경우에도 적용됩니다.

_{그림 11. BPAE 세포에서 역변환 적용 및 미적용 상태에서 캡처된 샘플을 보여주는 예시(Actin (BODIPY FL), 공진, 평균 64, ex. 488nm, Em. 500~540nm, 같은 여기 출력, UPLSAPO40x2/NA 0.95, CA 1 AU, 1024 × 1024픽셀.}

결과적으로 이 방법은 많은 수의 광자가 짧은 시간 동안 검출되는 경우에도 광자를 별개로 검출할 수 있는 신호 대 잡음비로 정확한 형광 검출을 가능하게 합니다. 실질적인 측정치를 말하자면 이 신호 대 잡음비로 포화 없이 초당 최대 1기가폰톤을 검출할 수 있습니다. 기존 단일 광자 계수 방법(마비성 또는 비마비성)[1]은 저주파 광자 검출률에서만 적용할 수 있지만, 현재의 기법은 HDR 광자 계수를 달성합니다. 이는 고속으로 매우 밝은 샘플을 이미지화하는 경우에도 신호 대 잡음비 측면에서 광자 계수 검출 방법과 비슷합니다(그림 12).

_{그림 12. 여기 강도와 출력 신호의 관계. 여기 출력을 증가시키면 한 번에 더 많은 광자 수를 검출할 수 있습니다. 기존의 광자 계수 방법을 사용하면 낮은 광자 검출률에서 출력 신호가 포화됩니다. SilVIR 검출기를 사용한 HDR 광자 계수는 고주파 입사 광자율에서도 포화되지 않습니다. 단일 광자 계수의그래프 곡선은 1.2nsec 펄스 페어 분해능으로 계산되었습니다.}

4-3. SilVIR 검출기의 장점

SilVIR 검출기 시스템은 SiPM 센서와 고속으로 샘플링된 디지털 처리를 함께 활용합니다. 이전 섹션에서는 이상적인 LSM 형광 검출과 기존 LSM의 상태 그리고 기존 LSM과 이상적 검출 방법 사이의 괴리에 대해 설명했습니다. 그러나 Evident는 SilVIR 검출기를 사용하여 이상에 가까운 LSM 형광 검출을 실현했습니다.

높은 감도 및 신호 대 잡음비

이상적인 검출 시스템은 광자 검출 효율(PDE)가 높고, 센서 또는 전기 회로 잡음이 없어야 합니다.

SilVIR 검출기는 두 가지 유형의 SiPM 센서를 사용하여 다이내믹 레인지와 신호 대 잡음비 중 하나를 포기하지 않고 가시광 범위와 NIR에서 더 높은 PDE를 달성합니다. 또한 전기 회로 잡음은 하나의 광자 수준 이하로 억제되고 암전류는 무시할 만한 수준으로 작기 때문에 광자 산탄 잡음이 SilVIR 검출기에서 지배적입니다. 그러므로 다음 공식에 따라 검출된 광자 수로부터 대략적인 신호 대 잡음비를 계산할 수 있습니다.

신호 대 잡음비(S/N ratio) = N/√N = √N

N: 검출된 광자 수

신호 대 잡음비를 더 쉽게 정량화할 수 있으므로 검출된 광자 수는 이미지를 공유하고 이에 대한 논의하고 일상적인 이미징 실험에서 이미지 품질을 재현하는 데 유용한 지표가 될 수 있습니다.

검출된 형광 강도의 정량성

이상적인 검출기는 정량적 척도로 검출된 형광의 양과 강도를 연관지을 수 있어야 합니다. 그러나 기존 기술을 사용할 경우 이러한 관계가 불분명하고 불확실합니다. SilVIR 검출기는 분명한 정량적 척도, 즉 광자 수를 사용하여 검출된 형광의 양을 정량화할 수 있습니다.

넓은 다이내믹 레인지

이상적인 검출기라면 하나의 광자부터 수천 개의 광자까지 검출할 수 있도록 다이내믹 레인지가 넓어야 합니다. 그러나 기존 기술을 사용할 경우 게인이 높으면 레인지가 좁아지고 게인이 낮으면 레인지가 넓어져 신호와 잡음 사이에 반비례 관계가 성립합니다. SilVIR 검출기는 게인이 높으므로 하나의 광자도 검출할 수 있으며, 다이내믹 레인지가 넓으므로 짧은 시간 동안 수천 개의 광자를 검출할 수 있습니다.

간단한 검출 설정(고정된 게인)

검출기는 설정 조정이 복잡해서는 안 됩니다. 그러나 기존 기술의 경우 사용자가 대상 형광의 밝기에 따라 고전압(HV)을 계속적으로 조정해야 합니다. 반면, SilVIR 검출기를 사용하면 사용자는 스캔 속도, 픽셀 크기, 프레임 통합(또는 평균화) 카운트만 조정하면 됩니다.

그림 13에서와 같은 이미지의 강도 히스토그램은 신호 대 잡음비가 높을 때 SilVIR 검출기가 형광 신호를 별개로 그리고 정량적으로 검출할 수 있음을 보여줍니다. 그림 13에서 강도는 빗과 같은 피크로 나타나며 대부분의 픽셀의 강도는 이러한 피크와 일치하는 강도 값에 집중되어 있습니다. 각 피크는 이전 섹션에서 설명한 대로 펄스 신호의 피크 값에서 식별된 검출 광자 수에 해당합니다. 예를 들어 특정 픽셀에서 검출된 펄스 신호의 피크 값이 단 1개의 광자인 경우, 피크의 강도는 1광자에 해당하고, 특정 픽셀에서 검출된 펄스의 피크 값이 2개의 광자인 경우 피크의 강도는 2광자에 해당됩니다. 마찬가지로 검출된 광자 수가 증가할지라도 강도 값은 검출된 광자의 피크 포지션으로 변환됩니다. 이러한 프로세스는 자연히 적은 양의 잡음과 오류를 포함하므로 많은 수의 광자가 검출되면 이러한 오류가 누적되어 빗 모양의 피크를 높은 강도에서 해석하기 어려워집니다. 그러나 잡음과 오류가 한 광자의 강도보다 작도록 억제되므로 히스토그램에는 별개로 검출된 광자가 빗 모양의 피크로 나타납니다. 표준 편차가 한 광자의 검출 강도의 대략 1/3인 잡음이 포함되었다고 가정하고 강도 분포를 시뮬레이션하면 3개 또는 4개의 광자보다 높은 피크는 해석할 수 없습니다.

따라서 신호 대 잡음비가 충분할 때 빛의 가장 작은 양자 단위인 1개의 광자를 잡음으로부터 분리하여 검출할 수 있습니다. 이는 이미지의 강도가 각 픽셀에서 검출된 광자 수에 상응하는 강도로만 구성되며, 오염된 잡음의 영향은 무효화되거나 인식되지 않을 수 있음을 의미합니다. 다시 말해, SilVIR 검출기는 신호 대 잡음비가 높을 때 기존 광자 계수 방법을 사용하여 얻은 이미지와 동등한 이미지를 얻을 수 있습니다. 또한, 기존 광자 계수 방법은 긴 노출로 낮은 수준의 형광을 검출할 때만 효과가 있지만, SilVIR 검출기는 고속으로 높은 강도의 형광을 이미지화할 때에도 높은 신호 대 잡음비로 검출할 수 있습니다. SilVIR 검출기는 이러한 획기적인 특징을 기반으로 정밀 형광 이미징을 가능하게 합니다.

FV4000 레이저 컨포컬 현미경의 경우, 그림 13의 가로 축에서 강도는 검출된 광자 수로 변환될 수 있으며, 이미지에서 강도 값에 대한 대안으로 표시될 수 있습니다. 피크의 간격이 동일하므로 빗 모양의 피크 사이의 너비로 광자 수를 변환할 수 있습니다. 구체적으로 말해, 기존 광자 계수에서 하나의 광자는 하나의 카운트였지만, SilVIR 검출기는 32개의 카운트를 출력하도록 설계되었습니다. Evident의 방법에서는 검출된 광자 수가 적을 경우에도 획득된 이미지에 특정 수준의 그라데이션이 있을 수 있습니다. 그러므로 낮은 광자 수 이미지를 누적 또는 평균화하여 신호 대 잡음비를 향상하는 동시에 광자 수 정보가 잡음 또는 오류에 묻히지 않도록 할 수 있습니다.

_{그림 13. FV4000 SilVIR로 획득된 형광 이미지 및 픽셀 강도 히스토그램. 히스토그램이 광자를 별개로 검출할 때 형성되는 빗 모양의 주파수 분포를 보여줍니다.}
 

5. SilVIR 검출기 예시 이미지

이 섹션은 SilVIR 검출기를 사용하여 캡처한 LSM 이미지를 보여줍니다.

GaAsP-PMT를 사용하여 캡처된 이미지와의 비교

그림 14는 SilVIR 및 GaAsP-PMT 검출기가 캡처한 녹색 형광에 대한 이미지를 보여줍니다. 일반적인 형광 강도를 달성하기 위해 샘플을 동일한 레이저 출력으로 여기했습니다. 강도가 상대적으로 강할 때, 즉 약 128개의 광자일 때 두 이미지 모두 이미지 품질이 비슷하지만 SilVIR 검출기는 광자 카운트를 직접적으로 표현합니다.

_{그림 14. SilVIR 및 GaAsP-PMT 검출기 모두 동등한 신호 대 잡음비로 밝은 샘플 이미지를 획득할 수 있습니다. 그림 14(a)는 550V에서 SilVIR 검출기를 사용하여 획득했고 그림 14(b)는 PMT로 획득했습니다. 최대 형광 강도는 약 128광자/2µs입니다.}

_{스캐너: 검류계 스캐너, 2µs/픽셀
여기: 488nm 레이저
방출: 500~540nm
BPAE 세포의 액틴 필라멘트(BODIPY FL)}

그러나 형광이 약한 경우에는 다릅니다. 그림 15는 약한 형광, 즉 약 12개의 광자가 있는 동일한 샘플을 두 가지 검출기로 캡처한 경우를 보여줍니다. SilVIR 검출기를 사용하여 캡처된 이미지의 잡음이 기존 GaAsP-PMT를 사용하여 캡처된 이미지보다 적다는 것을 알 수 있습니다. 또한, SilVIR 이미지의 강도 히스토그램은 빗 모양입니다. 이는 각 픽셀에서 광자 수가 정확하게 검출되었음을 의미합니다. 반면, GaAsP-PMT 이미지의 강도 히스토그램은 이미지 강도가 무작위인 것을 보여줍니다. 이로 인해 광자 정량화가 불가능해집니다. 또한, GaAsP-PMT의 경우 검출 대상 형광의 강도에 따라 고전압을 조정해야 하지만, SilVIR 검출기는 그렇지 않습니다.

_{그림 15. 이 그림은 700V에서 SilVIR 검출기(15a) 및 GaAsP PMT(15b)로 캡처한 매우 어두운 형광 샘플을 보여줍니다. 이 샘플을 같은 레이저 출력으로 여기했습니다. 최대 형광 강도는 약 12광자/2µs입니다. SilVIR 검출기로 캡처한 이미지의 강도 히스토그램은 빗 모양의 구조를 보여줍니다. 이는 광자 수가 정확하게 검출되었음을 의미합니다. PMT로 획득한 이미지의 배경에는 잡음이 더 많이 관찰되었습니다.}

_{스캐너: 검류계 스캐너, 2µs/픽셀
여기: 488nm 레이저
방출: 500~540nm
PtK2 세포의 마이크로튜블(Alexa Fluor 488)}

SilVIR 검출기를 사용하는 공진 스캐너의 높은 신호 대 잡음 이미지

SilVIR 검출기는 저강도 형광을 이미지화하는 데 적합합니다. 특히, 공진 스캐너를 사용하여 이미지를 획득할 때 픽셀-드웰 시간이 극도로 짧기 때문에 검출된 광자 수가 매우 작아서 신호 대 잡음비가 높은 이미지를 획득하기가 어렵습니다. SilVIR 검출기는 이러한 문제를 극복합니다. 그림 16은 1024 × 1024픽셀로 공진 스캐너를 사용하여 캡처한 이미지입니다. 누적 수가 다른 이미지가 나열되어 있습니다. 검출된 광자 수가 여러 광자일지라도 우수한 이미지 품질의 공진 스캐너 이미지를 얻을 수 있으며, 적은 수의 누적(또는 평균화)으로도 공진 스캐너 이미지를 처리하여 검류계 스캐너 이미지와 동등한 품질이 되도록 할 수 있습니다. 또한 이를 통해 이미지 획득 효율성도 향상할 수 있습니다.

_{그림 16. SilVIR 검출기와 1K 공진 스캐너를 사용하여 획득한 이미지. 그림 16(a)는 130msec/프레임에서 평균화가 없는 경우를 보여주고, 16(b)는 262msec/프레임에서 2배의 평균화를 수행한 경우, 16(c)는 522msec/프레임에서 4배의 평균화를 수행한 경우를 보여줍니다. SilVIR 검출기는 공진 스캐너를 사용하여 신호 대 잡음비가 높은 이미지를 획득할 수 있으므로 적은 평균화만으로도 고품질 이미지를 얻기에 충분합니다. 이를 통해 이미지 획득 효율성을 향상할 수 있습니다.}

_{공진 스캐너: 1024 × 1024픽셀 단방향, 픽셀 드웰 시간: 0.033µs
최대 형광 강도: 약 20개의 광자.}

SilVIR 검출기를 사용하여 스티칭된 이미지를 효율적으로 획득

넓은 영역을 대상으로 고해상도 이미지를 얻기 위해 이미지 스티칭을 자주 사용합니다. 검류계 스캐너를 사용하면 이 프로세스는 느리게 진행되지만 SilVIR 검출기와 함께 공진 스캐너를 사용하면 더 효율적으로 이 프로세스를 수행할 수 있습니다. 그림 17에서 4채널 1K × 1K 픽셀 이미지가 5 × 5 모자이크 필드에서 8개의 Z 슬라이스로 획득되었습니다. 검류계 스캐너를 사용하여 이미지를 캡처하는 데 30분 넘게 소요되었지만, 공진 스캐너를 사용한 경우 6분 미만이 소요되었습니다.

_{그림 17. SilVIR 검출기를 사용하여 효율적으로 이미지 획득. 공진 스캐너를 사용하여 스티칭된 Z 슬라이스 이미지를 최대 강도로 투사했습니다. SilVIR 검출기의 높은 신호 대 잡음비 때문에 더 많은 수의 이미지를 효율적으로 획득할 수 있습니다.}

SilVIR 검출기를 사용하여 하이 다이내믹 레인지 이미지 획득

기존 PMT 이미징에서는 다이내믹 레인지가 제한적입니다. 샘플이 어두운 객체와 밝은 객체로 구성된 경우, 두 가지 객체 중 하나를 우선시해야 합니다. 예를 들면, 그림 18에서 뉴런의 이미지를 획득할 때 형광이 약한 신경 섬유의 구조에 대한 선명한 이미지를 얻기 위해 세포체의 강도 포화가 불가피했습니다. SilVIR 검출기는 16비트 다이내믹 레이지 덕분에 포화 없이 밝은 영역과 어두운 영역을 모두 획득할 수 있습니다.

_{그림 18. SilVIR 검출기를 사용한 하이 다이내믹 레인지 이미징. 그림 18(a)의 기존 이미지에서는 밝은 세포체 일부가 쉽게 포화되었지만, SilVIR 검출기를 사용하여 캡처한 18(b)의 이미지에서는 세포체와 신경 섬유 모두 검출 범위 내에 있었습니다. 감마 디스플레이를 조정하여 어두운 신경 섬유에 대한 표현을 향상했습니다.}

SilVIR 검출기를 사용한 다색 이미징

가시광선부터 근적외선까지 SilVIR 검출기의 높은 감도와 신호 대 잡음비를 활용하면 크로스토스 효과를 방지하면서 6색 동시 이미징이 가능합니다(그림 16). 730nm으로 여기된 형광 염료는 GaAsP-PMT 검출기로는 거의 이미지화할 수 없지만, SilVIR 검출기는 신호 대 잡음비가 높은 이미지를 획득할 수 있습니다. FV4000 컨포컬 현미경은 최대 6채널 검출기를 장착할 수 있어 400~900nm의 나노미터 수준으로 정밀한 스펙트럼 해상도로 6가지 색상을 사용한 동시 이미징이 가능합니다.

_{그림 19. SilVIR 검출기 및 TruSpectral 기술을 사용하여 캡처한 6색 동시 이미지. 가시광선부터 근적외선까지 다색 동시 이미징이 가능합니다.}
 

6. 결론

기존 검출기와 비교할 때 SilVIR 검출기는 다음을 포함한 많은 장점을 제공합니다.

• 가시광선부터 근적외선까지의 파장 범위에서 높은 감도와 높은 신호 대 잡음비로 다색 이미징 수행
• 높은 광자 분해능(고속 및 하이 다이내믹 레인지 광자 계수)
• 감도 저하 없이 이미지 밝기 정량화를 통해 높은 실험 재현성 달성
• PMT처럼 게인을 조정하지 않아도 되므로 간편하게 작동 가능

이러한 장점 덕분에 광독성을 줄이면서 높은 신호 대 잡음비로 고속 고해상도 이미지를 더 쉽게 얻을 수 있습니다. 또한, 이미지 밝기를 광자 수로 정량화하므로 더 쉽게 이미징 조건을 공유하고 재현할 수 있습니다.

이뿐만 아니라, SiPM 센서는 향후 기술 발전 잠재력이 큽니다. 예를 들면, 앞으로 소개될 단일 광자 애벌란치 다이오드(SPAD) 어레이 센서를 위해 개발 중인 마이크로렌즈 어레이와 가드 링 공유(guard-ring-sharing) 기법[6]이 성공적으로 배포되면 PDE를 결정하는 매개변수 중 하나인 FF가 크게 향상될 수 있습니다. PDE가 향상되면 신호 대 잡음비, 다이내믹 레인지, 속도 및 픽셀 카운트 사이의 복잡한 관계에서 더 쉽게 균형을 유지할 수 있을 것입니다.

Evident는 기존 검출기와 관련된 문제를 극복하고 향후 빠른 속도로 발전할 수 있는 잠재력이 있는 SilVIR 검출기가 차세대 레이저 스캐닝 현미경의 표준이 될 수 있다고 생각합니다.
 

7. 참고 문헌

1. Hamamatsu Photonics “Photomultiplier Tubes: Basics and Applications 4th Edition” (Hamamatsu Photonics, 2017).
2. Hamamatsu Photonics “MPPC®” Cat. No. KAPD9005E04 (Hamamatsu Photonics, 2022).
3. J. Zheng, et al. “Dynamic-quenching of a single-photon avalanche photodetector using an adaptive