主页/ 应用注释利用采用 True 3D 技术的细胞分析软件的高通量 3D 类器官成像数据分析工作流程

利用采用 True 3D 技术的细胞分析软件的高通量 3D 类器官成像数据分析工作流程

引言

3D 类器官已被用于模仿生理微环境，以及收集对药物响应信号更详细的分析数据。类器官的多维成像可以生成信息丰富的数据，从而在数个时间点捕获到多个参数。但传统的图像分析软件往往没有针对建立批次分析路线来收集大规模成像数据的目的而进行优化。反直观的用户界面以及复杂的数据处理步骤使得高通量图像分析变得困难。在这项研究中，我们使用了奥林巴斯的 NoviSight 软件构建了一个更高效的 3D 类器官图像分析工作流程。

应用工作流程

好处

多孔 3D 成像数据的快速高效分析
通过批次分析实现的高稳定性
交互式数据呈现（缩略图图像库、热图、测量表、相关图和门控设置）

实验：药物疗法对取自结肠癌患者的肿瘤类器官的生长抑制疗效

方法

类器官培养物

取自结肠癌患者的肿瘤类器官在 Costar 96 孔板 (Corning) 中生长，并用临床使用的治疗药物伊立替康 (IR) 和 5-氟尿嘧啶 (5-FU) 以及阳性对照物星形孢菌素 (ST) 进行连续稀释处理。

使用 FV3000 激光扫描共聚焦显微镜进行的共聚焦成像

使用 FLUOVIEW FV3000 激光扫描共聚焦显微镜进行了类器官成像。用 10 倍物镜收集了 H2B-GFP 标记类器官图像。以 5 μm 步长采集了 Z 堆栈图像。

使用 NoviSight 3D 细胞分析软件进行的图像分析

加载图像文件
加载整个板的图像数据以同时分析多个图像。
建立分析
在“对象设置”（Object Settings）中，微调每个通道内对象的分割。
运行分析
建立分析设置后，对整个板运行分析。分析还可以“批次分析”方式运行，以对采样相同的分析工作流程同时分析多个数据集。

方便了 3D 类器官成像分析的 NoviSight 软件功能

分割预览

可以在预览窗口中可视化对探测阈值、自适应强度和筛选等分析设置的调整，以验证所需信号得到正确探测。此预览窗口可以切换到任何孔和 z 堆栈，无需重新调整设置，因而可以让用户在分析整个数据集之前快速而又全面地微调每个参数。

NoviSight 软件中的分割预览：未经任何调整的原始图像（左）和应用调整对象设置后显示探测到的 GFP 信号的预览图像（右）。

图形—门控

运行分析后，NoviSight 软件会自动生成数个图形，包括各种可自定义的图形。这些图形使用户能够选择对象以及通过特定参数对类器官进行门控。单击任何数据点都将突出显示原始图像中的对应对象，这在设置门控阈值时非常有用。然后，门控对象可以通过图库视图集体显示，从而使用户能够对大型数据集中对象分类的准确性进行快速评估。

显示每个孔各自的门控类器官表面积的散点图（左），和显示具有绿色荧光蛋白的整个平板中的门控类器官的图库视图（右）。

热图

NoviSight 软件会自动生成热图，使用户能够快速检查整个平板的数据。热图的颜色编码通过突出显示趋势和监控差异帮助简化数据分析。此外，选择孔会突出显示对应的原始图像。这种交互式功能最大限度地提高了基于成像的分析效率，因为用户可以方便地检查整个板的测量值或信号分布。

药物治疗后第 6 天的表面积值热图。第 C 行和第 4 列是未经处理的对照物。孔 D5 至 D9 分别用 1、0.1、0.001、0.0001 μM ST 进行了处理，孔 E5 至 E9 分别用 50、10、1、0.1、0.01 μM IR 进行了处理，孔 F5 至 F9 分别用 100、50、10、1、0.1 μM 5-FU 进行了处理。蓝色：较大的表面积。黄色：较小的表面积。

数据表

分析产生的数据被合并到一个表中，该表按孔对每个测量值进行平均。该程序还提供了与每个平均值相关的误差，并可通过“下载表”（Download Table）功能轻松导出为 .csv 文件。这些功能通过消除手动操作数据点和计算值的必要性，加速分析后处理并减少用户引起的差异性。与散点图和热图类似，在数据表上选择值也可以使用户在查看窗口中检查对应的图像，从而为数据验证过程提供支持。

显示各孔平均表面积值的数据表。

试料值设置和可重现性

完成数据分析后，NoviSight 软件允许用户将设置保存为“试验值”。之后可以将这些预定设置应用于包含类似成像条件和实验参数的任何其他数据集，如在多个时间点上成像的相同样品。这可以显著减少或消除数据分析中用户引起的差异性。

结果

类器官尺寸

在所有未经处理的类器官培养物中，类器官表面积随着时间的推移而增加，这表明类器官在生长。1 μM ST 处理导致表面积显著下降，因为药物杀死了类器官，导致了收缩。50 μM IR 处理显示表面积没有显著增加，表明生长受到完全抑制，而 100 μM 5-FU 处理显示表面积仅略有增加，表明该药物在抑制类器官生长方面不如 IR 有效。

未经处理、进行 1 μM ST、50 μM IR 和 100 μM 5-FU 处理的类器官表面积随时间的变化。（ST：对照物 n=153、ST n=208）、（IR：对照物 n=184、IR n=241）、（5-FU：对照物 n=172、5-FU n=183）

类器官形态

测量了球形度以量化类器官的形态变化。未经处理的对照组显示随着时间的推移球形度逐渐减小。1 μM ST 处理导致球形度发生后期跃升，表明与死亡类器官相关的结构转变。50 μM IR 和 100 μM 5-FU 处理的类器官的球形度测量结果与对照组没有显著差异，显现出的形态变化微不足道。

未经处理、进行 1 μM ST、50 μM IR 和 100 μM 5-FU 处理的类器官球形度随时间的变化。

结语—NoviSight 软件用于高通量 3D 图像分析的优势

我们利用 NoviSight 软件建立了一个快速高效的 3D 图像分析工作流程。自动生成的热图和图形等交互式 NoviSight 功能帮助我们可视化了大量数据，并可一目了然地确定趋势。分割预览和试料值设置存储等实用功能既加速了图像分析，同时又使用户能够产生更一致的结果。利用 NoviSight 软件的这些元素，我们得以在四个时间点测量三种不同药物治疗的 3D 类器官的七个形态参数（显示的表面积和球形度数据），最终使我们能够评价药物反应。这些结果表明 NoviSight 软件可用于高通量图像分析应用，如药物筛查。

作者