自然方法杂志每年都会回顾在过去一年推动生命科学行业发展的技术和方法，然后从中选出较受欢迎和较有影响力的技术和方法。2017年，《自然方法》杂志将类器官评为年度方法。从那以后，在广大科研工作者的不懈努力之下，类器官研究取得了丰硕的研究成果。
简单地说，类器官是可从组织或干细胞提炼的三维(3D)组织培养物。由于从本质上来说，类器官是人类组织或器官的简化微型版本，因此可用于多种研究。它们可以近似地模拟原位组织的生理结构和功能，并且可以经历多次传代稳定地保持遗传信息。
由于类器官能够模拟人体部位，研究人员可以利用它们：
- 深入了解器官的发育过程
- 测试药物的功能
- 开发再生疗法
这篇文章将探讨一些最新的类器官研究，并分享显微成像系统通过哪些方法推进这项重要工作。
类器官研究领域的进展
研究人员继续使用类器官开展新的研究。以下是一些值得注意的研究：
1.病人源性胶质母细胞瘤类器官模型和生物样本库重现了肿瘤间和肿瘤内异质性
2019年，细胞杂志发表了宾夕法尼亚大学研究人员的一篇名为“A Patient-Derived Glioblastoma Organoid Model and Biobank Recapitulates Inter- and Intra-tumoral Heterogeneity”（病人源性胶质母细胞瘤类器官模型和生物样本库重现了肿瘤间和肿瘤内异质性）的论文。论文报告了一个病人源性胶质母细胞瘤类器官(GBO)模型和生物样本库的建立。
该研究表明GBO保留了胶质母细胞瘤的主要特征，可以迅速用于为患者制定治疗策略。科研人员建立的生物库为胶质母细胞瘤基础和转化研究提供了丰富的资源。
研究人员记录了在显微镜下观察到的类器官的生长过程和形态变化。他们还利用共聚焦激光扫描显微镜技术观察了类器官中一些蛋白标记物的表达模式。
这项工作证明了类器官细胞的形貌和特征存在明显的异质性，并且它们的细胞组成与亲本肿瘤高度相似。
2.人前脑发育模型中的染色质可及性动态变化过程
2020年，科学杂志发表了题为“Chromatin accessibility dynamics in a model of human forebrain development”（人前脑发育模型中的染色质可及性动态变化过程）的论文。在论文中，研究人员介绍了创建人类前脑类器官的培养过程及其预期用途。他们展示了人类前脑类器官如何自行组装成前脑的不同部分。
更令人兴奋的是，研究人员还找到了一种方法，可以将人前脑类器官的寿命延长至长达300天。这段时间足以观察到前脑类器官发育为更复杂结构的过程。
3.人中间神经元祖细胞的扩增会加剧脑肿瘤和神经缺陷
2022年，《科学》杂志发表了题为“Amplification of human interneuron progenitors promotes brain tumors and neurological defects”（人中间神经元祖细胞的扩增会加剧脑肿瘤和神经缺陷）的论文。这项研究揭示了导致皮质发育畸形(MCD)的特定人类发育过程，而皮质发育畸形可能导致儿童发育迟缓和癫痫。
科研人员建立了结节硬化症(tuberous sclerosis complex, TSC)的人脑类器官模型，并鉴定了一种特定的神经干细胞类型，即尾部晚期中间神经元祖细胞(caudal late interneuron progenitor，CLIP)。在TSC中，CLIP细胞过度增殖，产生过多的中间神经元、脑肿瘤和皮层畸形。
类器官有望成为很好的发育、疾病和药物研究模型。它们在再生医学等其他领域也有着广阔的前景。但与粘附细胞相比，类器官的培养条件和结构更为复杂，因此在培养、观察和定量性数据分析方面仍面临许多挑战。
显微镜成像推进类器官研究的3种方法
幸运的是，显微镜成像设备可以帮助应对这些挑战。以下是显微成像系统和软件推进类器官研究的三种方法：
1.类器官的培养质控
类器官制备的典型方法是分离胚胎细胞或诱导性多功能干细胞，然后在支持介质（如基质胶）上培养这些细胞，使其能够三维生长。
将细胞因子、生长因子和小分子添加到培养基中，以激活或抑制参与形成类器官的特定信号通路。这些信号通路与调停体内等效器官发育和平衡维系的信号通路相同。
根据东京医科齿科大学研究所Takanori Takebe博士的研究，在继代培养过程中，增殖早期阶段的差异对接下来分化成类器官的效率有显著影响。他发现，在具有分化能力的iPS细胞系中，大多数单细胞在增殖早期传代后会粘附形成菌落。
Takebe博士假设抗分化iPS细胞系在未分化培养的早期阶段的细胞死亡率较高，使得iPS细胞集落数量较少，最终导致肝芽类器官分化效率较低。因此，要想可重现地形成类器官，既需要开发更优化的类器官分化方案，又需要优化原始未分化iPS细胞的培养。为了获得新的见解并改进实验方案，Takebe博士使用了我们的细胞培养监控系统。
通过利用CM30系统采集和分析培养样品的延时数据，研究人员可以了解iPS细胞在细胞培养过程中的状态，并找出提高分化效率的关键因素，从而进一步改进实验方案。
由于类器官的培养时间长，所需培养基以及维持其生长的添加剂价格较贵，因此研究人员必须特别关注类器官的培养过程及其生长状况以及避免污染。
得益于CM30系统的远程监控，无需进入无尘室将样本从培养箱中取出进行显微镜检查。这显著提高了实验效率并降低了污染风险。
培养箱中类器官的发育。使用CM细胞培养监控系统拍摄的图像。图像数据承蒙ACEL, Inc.提供。
2.类器官的显微镜成像
由于类器官是具有一定体积的3D细胞培养物，因此最好使用可采集多层Z轴图像信息的显微成像设备进行3D成像。这种功能可让您在成像中获得有关类器官形态特征和细胞内部结构的完整信息。
用于类器官成像的激光扫描共聚焦显微镜技术
激光扫描共聚焦显微镜适用于采集类器官的3D体积立体图像。得益于探测器前的针孔可阻挡失离焦背景，因此只有感兴趣深度的信息才会以高轴向分辨率捕获。
我们的FLUOVIEW FV4000共聚焦激光扫描显微镜采用SilVIR探测器进行精确成像，实现了高信噪比、更精确的成像以及高空间和光谱分辨率。SilVIR探测器采用了我们的专利*技术，可实现高动态范围光子计数，从而获得精确的3D成像数据。该技术还能重建精确的3D图像，非常适合用于研究类器官结构。
*专利号US11237047。
FV4000系统还提供成熟的近红外(NIR)解决方案。近红外成像具有穿透力深、光毒性低和组织自发荧光干扰小的优点。因此，它可与可见光范围内的各种荧光对比染色剂配合使用，对类器官进行无串扰的多色荧光成像，并有可能对类器官的活动进行长期监控。
使用FLUOVIEW激光共聚焦扫描显微镜连续观察3D培养细胞球体21天。细胞核用SYTOX Orange（红色）标记。细胞骨架用Alexa Fluor 488（绿色）标记。
用于类器官成像的多光子显微镜
要获得大体积类器官的完整图像，对成像深度有更严格的要求。多光子显微镜是适用于对类器官进行深层成像的显微成像系统。
以下概况说明了这些系统如何帮助进行类器官的深层成像：
我们的FV4000MPE多光子显微镜采用先进的光学设计，可优化深层成像的灵敏度和分辨率。400-1600 nm的波长范围支持更高效的IR激发，同时不影响可见光波长的探测。
其探测光路具有大通透光孔径和高效率，有助于汇收集更多的发射信号，尤其是大入射角的散射光子。此外，位于该系统核心的SilVIR探测器具有极低的噪声和高灵敏度，在整个可见光到近红外波长范围内具有高信噪比。
这些光学能力使您能够捕获类器官内部更深层的信息。TruResolution物镜通过自动球面像差补偿提高了深层成像的亮度和分辨率。这些高性能光学器件可在所有级别捕获3D图像中更多的细节信息。
用于类器官成像的超分辨率显微镜
大体积类器官对成像系统的要求更高。成像系统必须采集Z轴叠加图像并拼接所采集的图像，这就需要高速图像采集。这正是转盘共聚焦显微镜的用武之地。
虽然激光扫描显微镜使用单个针孔，但转盘共焦显微镜使用的是拥有数百个针孔并可以高速旋转的不透明圆盘。整个样品一次成像，而不是逐点成像，从而显著提高了成像速度，减少了光损伤。
我们的IXplore SpinSR超分辨率显微镜是一种转盘共聚焦系统，成像速度快、灵敏度高、光毒性低，并具有分辨率可精细到120 nm的可升级超分辨率模块。这些能力有助于对类器官进行快速Z轴叠加成像和图像拼接。
IXplore SpinSR系统还可与我们的硅油物镜系列配合使用。这些光学器件即使在对类器官进行深层成像时，也能获得清晰的超分辨率图像，并减少模糊。
我们的硅油物镜使用折射率为1.40的特殊硅油作为浸泡介质。这满足了采集高分辨率图像（高于水浸物镜）和观察高散射样本（如类器官和其他厚样本）的要求。
3.类器官图像的定量分析
到目前为止，我们阐述了如何使用激光扫描共聚焦显微镜、多光子显微镜和超分辨率显微镜等高端显微成像设备采集清晰的类器官宏观和微观图像。通过这些图像，研究人员可以观察到3D样本内部每个细胞甚至亚细胞层面的微细结构。
对于生命科学研究来说，仅仅观察样本的细节是不够的。在使用类器官模型进行药效验证和药物毒理分析的实验中，还需要对类器官及其内部细胞的形貌进行定性和定量分析。例如，比较多孔板中不同给药浓度下多个类器官之间的差异，可以获得更令人信服的统计学数据。
为了满足这些应用需求，我们开发了NoviSight细胞分析软件，用于在多孔板中培养的细胞球或类器官等样本的复杂3D细胞鉴定和分析。
以下是该软件在类器官研究方面的一些有用功能：
- 独特的真3D细胞分析技术有助于真实再现样品的空间形貌
- 多参数测量模块可帮助您快速识别类器官和细胞成分，并获得体积、表面积、空间距离和荧光强度等有用数据
- 交互式用户界面可让您轻松地将细胞图像与其统计数据相匹配，从而对数据进行准确的统计分析
由于类器官可以在基因和形态学两个层面上近似地模拟相应的人体组织，因此在模拟发育过程、疾病研究、临床免疫、肿瘤的药物敏感性、再生医学和精准医学等方面具有广阔的应用前景。
尽管如此，切记类器官仍是一项新兴技术。类器官的培养、质量控制和实验可重现性都存在局限性。类器官的基础研究、应用和转化还有很长的路要走。
凭借在光学器件和显微镜领域的丰富经验，Evident致力于在整个实验过程中为类器官研究人员提供支持。通过为类器官研究提供从样品制备到3D数据采集和分析的完整解决方案，我们致力于实现自身的使命——让世界变得更健康、更安全。
