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Do you know the function? - Differential Interference Contrast observation

その機能、使っていますか? ~微分干渉観察編~

無色透明のサンプルや生きている細胞などに適した観察方法としては、位相差観察のほかに、微分干渉観察(Differential Interference Contrast ; DIC)があります。
今回は微分干渉観察に焦点を当て、その仕組みと調整法をご紹介します。


微分干渉観察(Differential Interference Contrast ; DIC)とは・・・

光はサンプルを透過する際、そのサンプルを透過した部位の「屈折率」と「厚さ」の違いによって、透過した光の進む距離に違いが生じます。その距離の違いを“光路差”といい、微分干渉観察は、この光路差を利用して無色透明なサンプルを観察する方法です。
下の図1は、微分干渉観察と位相差観察とで、神経系細胞(NG108-15)を撮り比べしたものです。微分干渉観察では、あたかも細胞の斜め上方から光を当てたように細胞の縁に影が付き、立体的に見えることがわかります。(図1 A)

図1 微分干渉観察と位相差観察の比較
図1 微分干渉観察と位相差観察の比較

このように、微分干渉観察と位相差観察とではコントラストの付き方や像の特性が異なります。観察の目的によって適した観察方法を選択するようにしましょう。

微分干渉観察 位相差観察
コントラストの付き方 サンプルの厚さの勾配にコントラストが付く サンプルの境界や点にコントラストが付く
像の特性 立体感のある明暗、又は色のコントラストが付く
影の付き方に方向性がある
明暗のコントラストが付く
厚いサンプルでは、ハローが目立つ
コントラストの調整/選択 立体感のコントラストを微調整できる ネガティブコントラストとポジティブコントラストを選択できる
分解能 高い 微分干渉観察よりも劣る(※a)
適したサンプル 微細な構造から大きな構造まで観察できる
サンプルの厚さは数百μmまで可能
微細な構造の観察に有効である
サンプルの厚さは10μm程度まで可能
プラスチック容器の使用 不可能 可能

表1 微分干渉観察と位相差観察の比較
(※a)位相差観察は、リングスリットにより照明光が制限されるため、分解能が微分干渉よりも劣ります。


微分干渉観察の原理

下の図2は、微分干渉観察時の顕微鏡光路を模式的に示したものです。 微分干渉顕微鏡には、コンデンサー側と対物レンズ側にそれぞれ微分干渉プリズム(以下、DICプリズム)があります。その2つのプリズムを挟むように2つの偏光板「ポラライザー」と「アナライザー」が配置されています。
まず、光源からの光は、ポラライザーを透過して一方向に振動する光(偏光)に変換されます。そしてこの偏光は、コンデンサー側のDICプリズムによって二方向に振動する2本の偏光に分けられ、ほぼ平行にサンプルに当たります。しかし、2本の偏光は、わずかに進路がずれているため、サンプルの厚さが変化している部位を通るときには、サンプル内を通過する光の速度の違いにより、光路差が生じます。(図2-B (2))

図2 微分干渉観察の原理
図2 微分干渉観察の原理

そして、透明なサンプルを透過した2本の偏光は、対物レンズ側のDICプリズムによって再び同じ進路に合成され、アナライザーを透過します。このとき、この2本の偏光(a、b)間に光路差があると、干渉という現象が起こり明暗のコントラストが生じます。
このように微分干渉顕微鏡は、サンプルの厚さの勾配による光路差をコントラストに変換することで、透明なサンプルの観察を可能にしています。
それでは、さっそく微分干渉顕微鏡の構成と、調整の方法を確認していきましょう。


微分干渉顕微鏡の構成(各部の名称)

微分干渉観察を行うには、

  1. 明視野観察用コンデンサーの代わりに、ポラライザーとDICプリズムを内蔵した「ユニバーサルコンデンサー」が必要となります。
  2. また、対物レンズよりも上方に、「DICプリズム(DICスライダー)」と「アナライザー」が必要となります
ユニバーサルコンデンサ
ユニバーサルコンデンサー
(DICプリズム、ポラライザー内蔵)

顕微鏡外観画像
顕微鏡外観画像


微分干渉観察の基本調整方法

微分干渉観察を行う際は、明視野観察の操作に下記の調整が加わります。

  • 2つの偏光板「ポラライザー」と「アナライザー」の調整
    ポラライザーを透過した光がそのままアナライザーを透過しないように、ポラライザーとアナライザーが直交する状態に調整します。
  • DICプリズムの調整
    光路差による干渉作用が最大になるように、DICプリズムの位置関係を調整します。

 今回は、当社BX蛍光顕微鏡での基本的な調整方法をご紹介します。

1.初期設定 (DICプリズムを光路から外します)

  • (1)電源を入れます。

    (2)レボルバを回して、10×の対物レンズをセットします。

    (3)ユニバーサルコンデンサーのターレットを回して、“BF”の表示に合わせます。(※a)

    初期設定3

    (4)対物レンズ側のDICプリズムの側面を持ち、クリック感がするまで引き出します。

    初期設定4

    (5)粗動ハンドルを回して、ステージを一番上に上げます。

    (※a)BFとはbright field(明視野)の略です。この場合は「DICプリズムの入っていない穴」のことを指します。ターレットを回していくと、カチッとクリック感がする位置があります。これがターレットの止まる位置です。この場合は、ターレットの●印をBFの位置に合わせたときにクリック感があればOKです。


2.ポラライザーとアナライザーの調整

  • (1)ポラライザー挿脱つまみをつまんで、ポラライザーを一番奥まで押し込みます。

    ポラライザとアナライザの調節1

    (2)アナライザーの側面を持って、クリック感がするまでゆっくりと押し込みます。

    ポラライザとアナライザの調整2

    (3)どちらか一方の接眼レンズを外します。

    ポラライザとアナライザの調整3

    (4) 接眼レンズを外したほうの穴から鏡筒の中(対物レンズ瞳面)を覗きながらポラライザー回転つまみを回し、一番暗くなる位置(※b)で止めます。 そのとき、ポラライザー回転つまみ上に、目印になる白いマークが手前に見えていたら、正しい調整ができています。そして、ポラライザー固定つまみが付いている場合は、この固定つまみを回してこの状態で固定します。

    ポラライザとアナライザの調整4

    (5)接眼レンズを元の位置に戻します。

    (※b)この一番暗くなった状態のことを、クロスニコルと呼びます。この状態が、ポラライザーとアナライザーの振動方向が直交していることを意味します。

    ポラライザとアナライザの調整

3.DICプリズムの調整

  • (1)ユニバーサルコンデンサーのターレットを回して、DIC10の表示に合わせます。(※c)

    DICプリズムの調整1

    (2)対物レンズ側のDICプリズムの側面を持ち、クリック感がするまで押し込みます。

    DICプリズムの調整2

    (3)接眼レンズを覗きながら、対物レンズ側にあるDICプリズムのプリズム移動つまみを回し、視野が一番暗くなる位置付近で止めます。

    DICプリズムの調整

    (4)サンプルをセットします。

    (5)接眼レンズを覗きながら粗動ハンドルを回し、ステージを徐々に下げてサンプルにピントを合わせます。

    (6)接眼レンズを覗きながらXハンドルとYハンドルを回して、観察したい部位を視野の中心に移動させます。

    (※c)DIC10とは、10×の対物レンズに合ったDICプリズムの名称です。対物レンズの種類によって用いるDICプリズムが異なります。使用する対物レンズに合ったDICプリズムをセットします。(当社製品では、対物レンズの種類に対応した正しいDICプリズムの組み合わせは、ユニバーサルコンデンサーの取扱説明書にてご確認いただけます。)

4.視野の調整

倍率を変える場合(倍率を変えて観察するときの調整)

  • (1)レボルバを回して、観察したい倍率の対物レンズに切り換えます。
    (2)ユニバーサルコンデンサーのターレットを回して、対物レンズの種類に合ったDICプリズムをセットします。
    (3)接眼レンズを覗きながら微動ハンドルを回し、サンプルにピントを合わせ直します。
    (4)視野絞り環を閉じる方向に限界まで回して、視界を最小に絞ります。
    (5)接眼レンズを覗きながらコンデンサー上下ハンドルをゆっくり回し、コンデンサーを徐々に下げて視野絞り像がはっきりとクリアに見えるようにします。
    (6)接眼レンズを覗きながら、視野絞り環を開く方向に回し、視野絞り像の縁が視野内に見えなくなるギリギリの大きさにします。
    (7)接眼レンズを覗きながらプリズム移動つまみを回し、好みのコントラストになるように調整します。


対物レンズ側のDICプリズムとアナライザーが一体型の場合(明視野観察用の顕微鏡の場合)

  • (1)対物レンズ側のDICプリズムにアナライザーをはめ込みます。
    明視野観察用の顕微鏡の場合
    (2)(1)でアナライザーをはめ込んだDICプリズムの側面を持ち、クリック感がするまで押し込みます。
    明視野観察用の顕微鏡の場合2

    (3)プリズム移動つまみを右側に限界まで回します。

    (4)上記の1.初期設定(ステップ(1)~(3)、(5)の操作)と、2.ポラライザーとアナライザーの調整(ステップ(1)、(3))の操作を行います。

    (5)接眼レンズを外したほうの穴から鏡筒の中(対物レンズ瞳面)を覗きながらポラライザー回転つまみを回し、黒い斜線が1本だけはっきりと見える位置(右図参照)で止めます。(※d)
    このとき、ポラライザー固定つまみが付いている場合は、ポラライザー回転つまみをこの状態で固定しておきます。
    黒い斜線が1本はっきりと 見える状態
    黒い斜線が1本はっきりと見える状態

    (6)接眼レンズを元の位置に戻します。

    (7)3.DICプリズムの調整(ステップ(1)、(3)~(6))以降の操作を行います。

    (※d)黒い斜線が2本見える場合は、ポラライザーがアナライザーと直交する状態に対して90度ずれているので、ポラライザー回転つまみを回し続けて、黒い斜線が1本だけ見える状態にします。黒い斜線は、最初は真ん中に見えていませんが、プリズム移動つまみを少し戻すと、真ん中に見えてきます。


微分干渉観察の注意点

  • 観察するサンプルやレンズは、汚れをきれいに取り除いておくこと
    汚れがついていると、汚れにもコントラストがついてノイズの働きをしてしまいます。
    レンズのクリーニング方法はこちら
  • プラスチック容器は使用しないこと
    プラスチックはそれ自体が偏光を持つので、微分干渉観察には使用できません。容器も蓋もガラス製を使用します。
  • コントラスト(影の付き方)に方向性があります
    微分干渉観察では2本の偏光が分離された方向と平行な方向の変化だけがコントラストに変換されるため、観察像に方向性があります。コントラストの付ける方向を変えるには、ステージごとサンプルを回転させます。
    微分干渉像の例
  • コンデンサーには、対物レンズの種類に対応した正しいDICプリズムがセットされていることを確認すること
    対物レンズの種類によって用いるDICプリズムが異なります。使用している対物レンズの倍率に対応していないDICプリズムがコンデンサーに入っていると、微分干渉の効果がなくなり、正しいコントラストで像が見えなくなります。このため、コンデンサー側のDICプリズムが対物レンズの種類に対応していることを確認しておく必要があります。(当社製品では、対物レンズの種類に対応した正しいDICプリズムの組み合わせは、ユニバーサルコンデンサーの取扱説明書にてご確認いただけます。)

ここまでで、顕微鏡の仕組みを踏まえた基礎的な調整方法は終了です。まずは意識的に調整する習慣をつけて、体で方法を覚えていきましょう。


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