高通量药物筛选的3D空间分析

利用NoviSight™软件分析肿瘤微球的高速3D图像，以准确评估多个样品的药效。

引言

由于微球体现了复杂的肿瘤微环境，因此使用三维肿瘤微球评估药物的性能非常重要。研究人员由此能够在更加类似肿瘤自然环境的参数条件下评估药物的有效性。若要使用微球进行高通量药物筛选，研究人员必须使用简单的方案、半自动高速成像和多孔3D分析。 
在本研究中，我们使用没有液体交换的384孔板进行了均相细胞活力测定，使用FV3000RS激光扫描共聚焦显微镜的共振扫描振镜采集高速图像，并使用NoviSight 3D软件对图像进行分析。通过对3D微球进行分析更准确地评估多个样品的药效。
 

应用工作流程

优势

• 使用简单方案，无需进行液体交换
• 使用高速共振扫描振镜自动捕获图像
• 通过3D空间分析准确分析多个样品
   

方法

细胞制备

HeLa宫颈癌细胞植入384孔圆底孔板中（每孔100个细胞），并在含10％胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养24小时。将孔板轻轻离心以除去气泡。

样品制备

我们向样品中加入各种浓度的顺铂和星形孢菌素（STS）药物，并孵育24小时。利用膜通透性的差异，我们通过使用Thermo Fisher Scientific®的ReadyProbes™细胞活力成像试剂盒对总细胞与死细胞进行计数确定细胞活力（总细胞：蓝色/死细胞：绿色）。然后将样品染色并孵育5小时。这种简单制备方法不需任何液体交换、固定或从细胞植入到成像的洗涤操作。

成像和分析

我们使用配备LUCPFLN20X半复消色差物镜的FV3000RS激光扫描共聚焦显微镜获得微球的荧光图像。设置成像区域后，显微镜的共振扫描振镜可自动捕获图像。NoviSight™软件可从与诸如孔位置和样品位置等孔板相关信息配对的多个图像导入数据。导入后，软件将以3D形式重建图像。NoviSight软件可以识别诸如细胞核之类的对象，然后分析对象中的各种信号。
 

图1.无液体交换的高通量药物筛选方法
 

结果

多个样品的高速3D成像

大约花费一分钟时间观察了一个单孔（厚度2.33μm，122个切片，2个通道）的Z序列图像。顺铂和STS处理以剂量依赖方式增加了死亡细胞的数量（图2^*）。 

图2.微球药物反应的高速成像^*
 

微球药物敏感性的高通量3D分析

总细胞信号（蓝色）让我们能够识别细胞核（图3A^*）。然后，根据是否存在绿色信号（阳性信号：死细胞/阴性信号：活细胞）将所有细胞分为活细胞或死细胞。通过确认从图中所选择的图像对阳性信号和阴性信号进行分类（图3B^*）。分类后，可以使用软件中的热图轻松确定微球中死信号的总强度（图4A）。然后计算活细胞占总细胞的百分比并进行绘图（图4B）。结果表明两种药物对HeLa细胞高度敏感。

(A)

(B)

图3.NoviSight™软件可以根据信号识别和分类对象。^*
 

图4.热图分布和剂量响应曲线

药物敏感性的高通量空间分析

本研究中的图像通过三维捕获执行高级空间分析。使用NoviSight™软件，可以设置进行分析的目标区域。我们设置软件对每个微球的中心和外围进行分析（图5A）。然后，我们在这些区域内进行了细胞群分析。这种方法可以对多孔板上大量微球的药物功效进行空间分析。然后，该软件计算所有死细胞与中心和外围区域细胞数量的比率（图5B）。 
在这种情况下，中心和外围的死细胞数量均以剂量依赖性方式增加。与顺铂相比，星形孢菌素即使在低浓度下也对微球的中心部分有效。
 

图5.NoviSight软件可以对微球区域执行高级空间分析
 

结论

我们利用简单的方案、高速共聚焦成像和NoviSight软件获得了高通量3D图像，用于对微球中的细胞活力进行分类以及对药物反应性进行分析。这种空间分析技术可以对多个样品进行更高级的药物评估。

作者：

Hiroya Ishihara，生物评价技术2，研究与开发
 

*虽然它已经成为医学研究中最重要的细胞系之一，但我们必须认识到Henrietta Lacks对科学的贡献是在未经她同意的情况下发生的。这一不公正现象在导致免疫学、传染病和癌症方面重大发现的同时，也引发了关于医学中的隐私、伦理和同意方面的重要对话。
要了解更多关于Henrietta Lacks的生平和她对现代医学的贡献，请点击这里。
http://henriettalacksfoundation.org/