Verbesserung des Zellkulturprozesses mit den quantitativen Daten des CM20

Einführung

Zellkulturen sind der Ausgangspunkt für viele biowissenschaftliche und klinische Forschungen. Derzeit ist die Vorgehensweise bei Zellkulturen jedoch ineffizient und hängt stark von der Erfahrung und Technik erfahrener Forscher ab.

Bei dem aktuellen Verfahren entnehmen die Forscher die Zellen aus dem Inkubator und beobachten deren Zustand unter dem Mikroskop. Da dieser Prozess von Hand durchgeführt wird, variieren die Ergebnisse je nach Geschick und Erfahrung des Forschers. In manchen Labors kultiviert jeder Forscher mehrere Zelllinien, so dass es schwierig ist, die für Experimente notwendige Zellqualität aufrechtzuerhalten. Um quantitative Daten, beispielsweise zur Anzahl der Zellen, zu erhalten, mussten die Proben von der Gefäßwand abgelöst und nach jeder Messung entsorgt werden. Ergebnis dieses zeitaufwändigen Prozesses sind oft lückenhafte Daten. Für diese Herausforderungen entwickelte Olympus das Inkubationsüberwachungssystem CM20.

Zellkulturmessung mit dem Überwachungssystem CM20

Das Inkubationsüberwachungssystem CM20 liefert zerstörungsfreie Messdaten, während die Zellkulturen im Inkubator verbleiben. Die moderne Technologie des Scanners ermöglicht konsistente, reproduzierbare Messungen, um den Arbeitsaufwand und die Schwankungen zu reduzieren, die unvermeidbar sind, wenn jeder Forscher seine eigenen Messungen durchführt (Abbildung 1).

Abbildung 1: Kontinuierliche Messung

Kontinuierliche Bildaufnahme

Das System ist einfach zu bedienen. Zunächst wird das Kulturgefäß auf das Überwachungssystem CM20 gestellt und es werden die Beobachtungszeit und -position eingestellt. Danach beginnt das System mit der Bildererfassung (Abbildung 2). Damit entfällt für die Forscher die Notwendigkeit, einen Zeitplan zur Beobachtung der Kulturen zu erstellen und die Beobachtungsposition von Hand zu erfassen. Da das System außerdem Veränderungen in der Kultur im Zeitverlauf und jeweils an denselben Positionen überwacht, lassen sich Verhalten und Wachstumsprozesse der Zellen kontrollieren (Abbildung 3).

Abbildung 2: Zellenmessung vergleichen 
 

Abbildung 3: Änderungen über die Zeit an derselben Position beobachten

Quantitative Daten mit weniger Aufwand

Mithilfe von Bildverarbeitung und maschineller Lerntechnologie kann das Überwachungssystem CM20 Zellen zählen, eine Konfluenzanalyse anhand der Bilder durchführen und dann mit einfachen Parametereinstellungen quantitative Daten erstellen. Wenn z. B. die von erfahrenen Forschern eingestellten Parameter im Labor gemeinsam genutzt werden, wird immer die gleiche Analyse für die aufgenommenen Bilder durchgeführt, so dass konsistente Ergebnisse erzielt werden.
 

Zellzählung

Die Anzahl der Zellen wird mit Hilfe eines Algorithmus berechnet, der die Zellkerne anhand der maximalen Helligkeit identifiziert. Er kann durch Ändern der Zellgröße und der Kontrastparameter angepasst werden (Abbildung 4).

Abbildung 4: Zellzählung; die Zellkerne sind blau markiert.

Konfluenzanalyse

Die Zellkonfluenz wird durch einen Algorithmus berechnet, der die Eigenschaften der Helligkeitsänderungen zwischen der Zelle und dem Hintergrund des Bildes auswertet. Als Parameter können der Zellanteil und der Hintergrund durch Markieren der Bilder und anschließendes maschinelles Lernen angepasst werden (Abbildung 5).
 

Abbildung 5: Konfluenzanalyse (links: für maschinelles Lernen markiertes Bild, rechts: Ergebnis der Konfluenzanalyse)

Vergleich des Zellwachstums verschiedener iPS-Zelllinien

Zum Vergleich der Ergebnisse des Überwachungssystems CM20 und eines Forschers, der Zellkulturen von Hand überprüft, arbeiteten wir mit iPS Portal, Inc. zur Erfassung der Daten von zwei Zelllinien zusammen.

Zellen：iPS-Zellen（1231A3、201B7）
Zeitraum：1 Woche
Gefäß：6-Well-Platte
Forscher：1 Person

Abbildung 6: Es wurden zwei Überwachungssysteme CM20 in den Inkubator mit den Kulturgefäßen gestellt, jedes Kulturgefäß enthielt eine Zelllinie.
 

Nach den Erfahrungen des Forschers vermehrte sich Zelllinie 1231A3 leichter als Zelllinie 201B7. Da die konventionelle Datenerfassung jedoch kompliziert ist, war der Unterschied der proliferativen Kapazität nicht eindeutig. Zur Beurteilung haben wir Bilder und Konfluenzdaten für jede Zelllinie mit dem Inkubationsüberwachungssystem CM20 erfasst.

Abbildung 7: Die qualitative Information in den Bildern zeigt die unterschiedliche Zellkonfluenz zwischen den beiden Zelllinien am gleichen Kulturtag.
Abbildung 8: Aus den quantitativen Angaben zur Zelldichte, insbesondere nach Tag 5, wird deutlich, dass die Proliferationsfähigkeit der Zelllinie 1231A3 3 % bis 6 % höher war als der Zelllinie 201B7.

Mit den oben genannten Daten wurde der Unterschied in der Wachstumsrate der beiden Zelllinien, die der Forscher durch Intuition und Erfahrung erkannte, durch die quantitativen Daten mit dem System CM20 bestätigt. Dies demonstriert einen wichtigen Vorteil des Inkubationsüberwachungssystems CM20—selbst wenn der zuständige Forscher wechselt, gibt es kaum Abweichungen bei den Zellkonfluenzdaten, da alle Kulturen mit dem System CM20 überprüft werden. Wenn ein anormaler Wert auftritt, ist es einfach, ihn zurück zu verfolgen und die Ursache zu untersuchen. Darüber hinaus lassen sich durch Erfassung dieser Daten für jede Zelllinie die Eigenschaften der Zellkulturen nachvollziehen und Experimentübergänge zum richtigen Zeitpunkt durchführen.

Zusammenfassung

Mit dem Inkubationsüberwachungssystem CM20 lassen sich tägliche Zellkulturdaten (Zellbilder, Zellzahlen und Zellkonfluenz) einfach und intuitiv erfassen. Mit diesen Daten kann der Anwender Faktoren, die Schwankungen in der Zellkultur verursachen, besser verstehen und beseitigen und so die Zellqualität und die Reproduzierbarkeit von Zellexperimenten verbessern.

Autor

Shogo Usui
SSPD Electrical Engineering
Olympus Corporation